Parkin與OGCP相互作用研究及OGCP基因的突變檢測(cè).pdf

1、第一部分Parkin與OGCP相互作用研究 ParkSn基因是帕金森病的致病基因之一，Parkin蛋白作為泛素-蛋白酶體通路(UPP)的一種E3酶，介導(dǎo)了多種底物蛋白的泛素化過程，后者與帕金森病的發(fā)病機(jī)制有著密切的聯(lián)系。α-酮戊二酸載體蛋白(OGCP)位于線粒體上。在本課題中，我們對(duì)Parkin與OGCP之間的相互作用進(jìn)行研究。 應(yīng)用PCR技術(shù)從人胎腦cDNA文庫擴(kuò)增全長的Parkin和OGCP基因的CDS，亞克隆至pC

2、MV-Tag4和pcDNA3.l-myc-his(一)B表達(dá)載體，構(gòu)建Parkin和OGCP的真核表達(dá)載體pCMV-Parkin和pcDNA3.1-myc-OGCP，經(jīng)測(cè)序證實(shí)了載體構(gòu)建正確。將pCMV-Parkin和pcDNh3.1-myc-OGCP轉(zhuǎn)染到HEK293細(xì)胞中，用免疫印跡、免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡等技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)pCMV-Parkin和pcDNA3.1-myc-OGCP能正確地表達(dá)出Parkin-Flag融合蛋白(54

3、KD)和OGCP-myc融合蛋白(38KD)；Parkin-Flag融合蛋白分布在胞漿和胞核中，而OGCP-myc融合蛋白分布在胞漿中，定位在線粒體上；Flag和myc與Parkin和OGCP的融合并沒有改變Parkin和OGCP的亞細(xì)胞定位。此外，還成功地建立了OGCP-myc穩(wěn)定表達(dá)的HEK293細(xì)胞。 應(yīng)用免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡共定位技術(shù)，發(fā)現(xiàn)在共轉(zhuǎn)DCMv-Parkin和pcDNA3.1myc-OGCP的HEK293

4、細(xì)胞中，Parkin-Flag融合蛋白和OGCP-myc融合蛋白存在共定位；免疫共沉淀試驗(yàn)證實(shí)了Parkin-Flag融合蛋白和OGCP-myc融合蛋白存在相互作用。表明Parkin和OGCP是一對(duì)相互作用蛋白。 體外泛素化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Parkin-Flag融合蛋白在E1酶、UbcH7和泛素存在的條件下，能介導(dǎo)OGCP-myc融合蛋白泛素化；體內(nèi)泛素化實(shí)驗(yàn)也證明Parkin-Flag融合蛋白能介導(dǎo)OGCP-myc融合蛋白泛素化。表明

5、OGCP是Parkin的底物蛋白，Parkin介導(dǎo)了OGCP的泛素化。 用特異的蛋白酶體抑制劑和蛋白酶抑制劑對(duì)OGCP-myc／HEK293細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)這些抑制劑能減緩OGCP-myc融合蛋白的代謝和更新，提示蛋白酶體途徑和溶酶體途徑都參與了OGCP代謝。通過同位素<'35>S標(biāo)記的脈沖追蹤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)OGCP-myc融合蛋白的代謝半衰期大約為8-10小時(shí)，Parkin-Flag融合蛋白能促進(jìn)OGCP-myc融合蛋白的代謝和