肝病關(guān)聯(lián)基因IL-10-ESR1 rSNP的鑒定及其在HBV相關(guān)肝病中的功能研究.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)主要的感染病之一，其疾病表型多種多樣，從無癥狀攜帶、急性肝炎、慢性肝炎、重型肝炎到肝衰竭、肝硬化、肝細(xì)胞癌，形成了復(fù)雜的疾病譜。HBV感染相關(guān)肝病的發(fā)生和發(fā)展是環(huán)境，病毒和宿主相互作用的結(jié)果。宿主因素，尤其是宿主基因，影響HBV感染和疾病進程的許多階段。分離分析和雙生子研究提示宿主遺傳因素對HBV感染相關(guān)肝病疾病表型起著關(guān)鍵的作用。隨著人類基因組計劃的完成，有關(guān)個

2、體遺傳變異與疾病的關(guān)系日益受到重視，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)是人類基因組中遺傳學(xué)變異最常見的一種類型，也是決定不同個體臨床表型多樣性的重要因素。因此探討HBV感染相關(guān)肝病的宿主遺傳易感性，將為我們從另一角度認(rèn)識HBV感染及發(fā)病機制提供新的線索，并為臨床防治提供新的、合理的策略。 以生物學(xué)功能相關(guān)基因作為候選基因進行病例-對照關(guān)聯(lián)研究，是當(dāng)前對復(fù)雜疾病進行遺傳易感性研究

3、的重要策略。本課題組前期在中國人群15個HBV易感侯選基因的啟動子區(qū)和外顯子區(qū)進行了SNP的測序發(fā)掘。經(jīng)病例對照研究、核心家系傳遞不平衡測試，已確定雌激素受體旺(estrogen receptorα，ESR1)、干擾素-γ誘導(dǎo)的10KD蛋白分子(IP-10，CXCL10)和白介素10(interleukin10，IL-10)等多個基因與HBV感染及其疾病進程相關(guān)。但既往研究多集中在侯選基因關(guān)聯(lián)SNP的發(fā)掘和HBV感染的關(guān)聯(lián)研究上，對陽性

4、關(guān)聯(lián)位點與其他HBV感染相關(guān)肝病的關(guān)聯(lián)研究還未見報道，對侯選基因的功能性SNP的鑒定也還不夠深入。進一步研究肝病關(guān)聯(lián)基因IL-10/ESR1基因多態(tài)性與其他HBV相關(guān)肝病(HBV相關(guān)急性肝衰竭和/或肝硬化)的易感性之間的關(guān)系以及鑒定對疾病發(fā)生發(fā)展起直接作用的調(diào)節(jié)性多態(tài)性位點，將有助于我們?nèi)胬斫釯L-10/ESR1基因多態(tài)性在HBV感染慢性化和重癥化機制中的作用。 因此，我們選擇IL-10和ESR1兩個基因為候選基因，擬在中國人

5、群中分析其基因多態(tài)性尤其是非編碼區(qū)(啟動子和內(nèi)含子區(qū))基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝病的關(guān)系，并對陽性關(guān)聯(lián)SNP位點的生物學(xué)功能意義進行功能驗證，從遺傳學(xué)角度探討基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝病的易感性及發(fā)病機制的關(guān)系。 本研究擬收集本研究所需的病例對照研究的臨床資料和DNA樣本，綜合采用限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)、擴增折射變異PCR(ARMS-PCR)和直接測序法在我們收集的基于醫(yī)院的病例(如HBV相關(guān)急性肝衰竭，H

6、BV相關(guān)型肝硬化）對照(如健康獻血員，HBV感染無癥狀攜帶者)人群中對選擇的IL-10基因啟動子區(qū)3個SNPs(A-1082G，T-819C和A-592C)位點以及ESRl基因與陽性關(guān)聯(lián)位點T29C連鎖的3個SNPs(IVS1 T-401/C，T29C和A252966G)位點進行基因分型、連鎖不平衡檢測、單倍型分析和關(guān)聯(lián)研究。然后綜合采用熒光素酶報告基因試驗(DLRA)、電泳移動漂移分析(EMSA)、單倍型等位特異性染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(

7、HaploChIP)、位點特異性小RNA干擾(SiRNA)等手段對陽性關(guān)聯(lián)的標(biāo)簽SNPs(IL-10 A-592C和ESR1 IVSl T-401C位點)進行功能驗證。 我們的主要研究結(jié)果如下： 1.新收集了1000余份HBV感染患者的病例資料和血樣，完成了所有樣本(5000余例)的整理和疾病表型的歸類。 2.我們在345名HBV相關(guān)急性肝衰竭患者，367例HBV感染無癥狀攜帶者和414名健康獻血員正常對照中成功

8、進行了IL-10基因啟動子區(qū)3個SNPs位點(A-1082G，T-819C和A-592C)分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)急性肝衰竭患者病例組中-592C和-819C的等位頻率顯著高于HBV感染無癥狀攜帶者疾病對照組和健康獻血員正常對照組(P=6.9×10-7)。經(jīng)非條件logistic回歸校正年齡、性別、飲酒指數(shù)等因素后，在顯性模式下，IL-10 A-592C和T-819C兩個SNP位點與HBV相關(guān)急性肝衰竭顯著關(guān)聯(lián)。和-592A/C或A/A

9、基因型個體相比，C/C基因型的個體對HBV相關(guān)急性肝衰竭易感性顯著升高(顯性模式：OR=2.07，95％CI1.47-2.92，P=0.0000)。 3.我們在359名HBV感染相關(guān)急性肝衰竭患者，469名HBV感染相關(guān)肝硬化患者和468例HBV感染無癥狀攜帶者對照中進行ESR1基因3個SNPs位點(IVS1 T-401C，T29C，A252966G)的分型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBV相關(guān)急性肝衰竭患者病例組和HBV相關(guān)肝硬化患者病例組中I

10、VS1-401C和29C的等位頻率顯著高于HBV感染無癥狀攜帶者疾病對照組。經(jīng)非條件logistic回歸校正年齡、性別等因素后，IVS1 T-401C和T29C兩個SNP位點與HBV相關(guān)急性肝衰竭(分別為P=0.0246，P=0.0071)以及HBV相關(guān)肝硬化(分別為P=3.0×10-4，P=5.4×10-6)的易感性顯著關(guān)聯(lián)。ESR1基因單倍型29C-401C增加了HBV相關(guān)急性肝衰竭(顯性模式：P=0.0116，OR=1.46，95

11、％CI1.08-1.96)以及HBV相關(guān)肝硬化(顯性模式：P=0.0000，OR=1.83，95％CI1.38-2.44)易感性。 4.體外EMSA實驗證實HBV感染相關(guān)急性肝衰竭相關(guān)聯(lián)的IL-10啟動子區(qū)A-592C位點存在核蛋白結(jié)合位點，且兩種等位的結(jié)合能力存在差異。活體狀態(tài)下的ChIP實驗證實A-592C位點兩種等位都能與RNA多聚酶II特異性結(jié)合，但兩種等位的結(jié)合量表現(xiàn)為等位特異性差異，C等位的RNA多聚酶II特異性結(jié)合

12、量大于A等位，說明IL-10基因啟動子-592C等位對IL-10表達的調(diào)控能力強于A等位。IL-10基因表達分析表明，攜帶有-592C等位的個體PBMC中IL-10 mRNA的表達和細(xì)胞因子水平也比不攜帶有有-592C等位的個體強。說明IL-10 A-592C兩個等位對IL-10的表達調(diào)控能力存在差異，C等位強于A等位。IL-10 A-592C位點是一個功能性調(diào)節(jié)性SNP，-592C等位通過上調(diào)IL-10基因的表達而增加了HBV相關(guān)肝衰

13、竭發(fā)病的危險因素。 5.采用熒光素酶報告基因試驗、EMSA、HaploChIP、位點特異性RNA干擾等手段，多個角度首次證實了ESR1外顯子1 T29C位點連鎖的內(nèi)含子1 IVS1 T-401C位點的等位特異性順式調(diào)控作用，IVS1 T-401C位點兩個等位通過對核蛋白C-myb的結(jié)合能力的差異從而影響了ESR1的表達(mRNA和蛋白水平)，-40lC等位對核蛋白C-myb的結(jié)合能力更強，表現(xiàn)出更強的增強子活性，可能通過影響了E

14、SR1表達量而增加了HBV相關(guān)肝衰竭和肝硬化發(fā)病的危險因素。 總之，我們通過大樣本的病例對照研究在群體水平和流行病學(xué)角度首度證實了IL-10和ESR1基因多態(tài)性與HBV感染相關(guān)肝病(ALF和LC)的關(guān)聯(lián)，并通過系列功能研究證實陽性關(guān)聯(lián)位點IL-10啟動子區(qū)A-592C和ESR1 IVS1 T-401C位點為功能性調(diào)節(jié)性SNP(regulatory SNP，rSNP)，其與疾病的關(guān)聯(lián)并不單純是一種標(biāo)志的間接關(guān)聯(lián)，而是通過影響了基因