利用PolⅡ-ChIP技術(shù)鑒定肝病關(guān)聯(lián)基因ESR1-CXCL10rSNP的初步研究.pdf

1、慢性乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染是世界范圍內(nèi)主要的感染病之一，HBV的持續(xù)感染與病毒、環(huán)境和宿主的遺傳感染易感性等密切相關(guān)，研究慢性HBV感染及其相關(guān)肝病的遺傳易感性具有十分重要的意義。單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)構(gòu)成人類基因組90％以上的變異，被廣泛用于連鎖分析與疾病易感性等研究。我科前期病例對照分析和疾病關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)雌激素受體α(ESR1)和CXCL

2、10基因與慢性HBV感染及其疾病進程相關(guān)。兩個基因中，關(guān)聯(lián)的標(biāo)記SNP位點均位于非編碼區(qū)，關(guān)聯(lián)區(qū)域均無高頻編碼區(qū)SNP(cSNP)位點。通過功能實驗鑒定與疾病直接相關(guān)的ESR1和CXCL10基因調(diào)節(jié)性SNP(regulatorySNP,rSNP)是十分必要的，目前尚未見這方面研究的文獻報道。 由于SNP為雙等位多態(tài)，兩種等位多態(tài)之間僅有1個堿基的差異，其功能研究必須在表達水平或蛋白水平揭示單堿基等位特異性的差異。對于非編碼區(qū)(啟

3、動子或內(nèi)含子區(qū)域)的關(guān)聯(lián)位點，SNP的等位特異性差異無法在mRNA轉(zhuǎn)錄本得到反映，通常以該SNP位點附近序列為對象，通過報告基因試驗研究不同等位對該序列啟動子活性的影響，或通過電泳移動漂移實驗(EMSA)分析不同等位的寡核苷酸探針結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子能力的差異。我們鑒定出的疾病關(guān)聯(lián)SNP位點位于基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)，緊密連鎖不平衡的區(qū)域內(nèi)存在眾多的SNP，要找出其中與疾病直接相關(guān)的rSNP，用上述兩種方法存在困難，迫切需要發(fā)展快速、高通量、多位點協(xié)同

4、的rSNP功能研究方法。 本研究試圖利用近幾年來發(fā)展的一種DNA-蛋白相互作用研究技術(shù)—染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(chromatinimmunoprecipitation，ChIP)為基礎(chǔ)而建立的一種高通量的技術(shù)—PolⅡ-ChIP技術(shù)，通過測定等位特異性的RNA多聚酶來反映雙等位的SNP等位表達量的差異，從而鑒定出影響肝病的rSNP位點。 采用常規(guī)方法培養(yǎng)多種細胞；其中對HepG2細胞株基因組DNA和cDNA中的SNRPN基

5、因用RT-PCR為基礎(chǔ)的RFLP方法進行基因分型，檢測出SNRPN(小核核糖核蛋白多肽N)基因在肝癌腫瘤HepG2細胞株中的表達狀況；通過對ChIP技術(shù)中固定、超聲、免疫沉淀、洗滌等關(guān)鍵步驟的摸索，優(yōu)化出重復(fù)性好、穩(wěn)定性高的PolⅡ-ChIP技術(shù)方案；利用PolⅡCTD末端Ser5特異性抗體進行染色質(zhì)免疫沉淀，針對SNP位點兩側(cè)序列設(shè)計PCR引物和延伸引物，以外側(cè)引物進行PCR擴增，采用延伸引物進行VSET引物延伸，產(chǎn)物純化后經(jīng)MALD

6、I-TOF質(zhì)譜鑒定。對對數(shù)生長期的HepG2肝癌細胞株和L02細胞株分別用β-雌二醇刺激后進行PolⅡ-ChIP，針對文獻報道的8個可能啟動子區(qū)設(shè)計引物進行擴增、測序，鑒定ESR1基因啟動子的使用情況并試圖發(fā)掘可能存在的調(diào)節(jié)性SNP。采用PolⅡ-ChIP和MGB-熒光定量PCR檢測CXCL10G49392A位點的等位特異性調(diào)控活性。 我們的主要研究結(jié)果如下： 1.HepG2細胞SNRPN外顯子4nt1654312位點(

7、數(shù)字依據(jù)NT026446，SNPrs705)為雜合子(C/T)；RT-PCR為基礎(chǔ)的RFLP分析表明，SNRPN的雙等位基因中只有一個等位基因的產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄本，其基因印跡狀態(tài)未丟失。 2.通過對ChIP技術(shù)中固定、超聲、免疫沉淀、洗滌等關(guān)鍵步驟的摸索，優(yōu)化出比較成熟的ChIP技術(shù)方案。 3.以印跡基因SNRPN為研究對象，對雜合子細胞的SNRPNC1654312TSNP進行PolⅡ-ChIP-PE-MS分析發(fā)現(xiàn)，基因

8、組DNA樣本和染色質(zhì)免疫沉淀前樣本在C、T等位點都包含相同PolⅡ結(jié)合量，但免疫沉淀后標(biāo)本(被磷酸化RNA多聚酶Ⅱ結(jié)合的染色質(zhì))就僅在T等位點有結(jié)合，與產(chǎn)生mRNA轉(zhuǎn)錄的等位點相對應(yīng)。采用PolⅡ-ChIP技術(shù)鑒定疾病關(guān)聯(lián)rSNP是可行的，具有重復(fù)性好，穩(wěn)定性高的優(yōu)點。 4.β-雌二醇刺激不同肝細胞后進行PolⅡ-ChIP發(fā)現(xiàn)，HepG2肝癌細胞株中ESR1啟動子E1、E2、F沉淀出有PolⅡ的結(jié)合的片段，而在L02細胞株中則僅

9、啟動子D有PolⅡ的結(jié)合的片段沉淀出來。 5.針對ESR1基因啟動子區(qū)域的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，ESR1基因啟動子區(qū)D區(qū)198104位點存在SNP(T/A)以及198461位點存在SNP(G/T)。 6.采用PolⅡ-ChIP和MGB-TaqMan探針熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)CXCL105'側(cè)翼G49392A位點的存在轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性的等位特異性差異，G等位高于A等位。 總之，我們優(yōu)化出比較成熟的ChIP技術(shù)方案，驗證了P

10、olⅡ-ChIP技術(shù)通過檢測雜PolⅡ結(jié)合量來反映SNP雙等位表達量的差異的可靠性，可以利用PolⅡ-ChIP策略鑒定疾病關(guān)聯(lián)基因SNPs的功能，為后續(xù)研究優(yōu)化出可靠的技術(shù)平臺。利用PolⅡ-ChIP技術(shù)鑒定并證明了ESR1的表達在不同肝細胞中受不同的啟動子的調(diào)控。HepG2肝癌細胞株中ESR1的表達受啟動子E1、E2、F調(diào)控，而在L02細胞株中ESR1的表達受啟動子D調(diào)控，初步發(fā)掘出兩個位于啟動子區(qū)可能是潛在的rSNP的位點。初步證實