ChIP-chip技術篩選胃癌相關抑制基因及其表遺傳學調控機制的研究.pdf

1、前言：
　　胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤之一。在世界范圍內，在男性中其死亡率居癌癥死因的第二位，而在女性中其死亡率居癌癥死因第三位。我國胃癌發(fā)病率居各類腫瘤的首位，約42％的胃癌病人出現在我國。大部分病人診斷時已處于進展期，預后不良。因此，需要對胃癌發(fā)生、發(fā)展的分子學機制進行進一步的研究。
　　近年來，越來越多的證據證實表遺傳學的改變在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起到至關重要的作用。這些表遺傳學包括組蛋白修飾、DNA甲基化是不依賴基因

2、的突變和缺失而導致基因失活的重要機制。胃癌相關抑制基因的失活往往伴隨著異常的組蛋白修飾、DNA甲基化。其中，組蛋白修飾被稱為“組蛋白密碼”可以影響染色體的結構和基因的轉錄，在腫瘤的形成中起到很關鍵的作用。組蛋白賴氨酸的甲基化和乙?；莾煞N研究最為透徹的組蛋白修飾方式，被認為參與多種分子生物過程的調控，如基因的激活和失活，X-染色體的活化，DNA的修復以及細胞周期的調控等。其中，高水平的H3K9乙酰化和H3K4三甲基化被認為可以激活基因轉

3、錄，而高水平的H3K9三甲基被認為與基因的失活相關。
　　在后基因時代，高通量技術的出現使在基因組水平上對腫瘤細胞進行分析成為可能。染色質免疫沉淀結合芯片(ChIP-chip)已經被廣泛用于基因組水平腫瘤的研究。在本項研究中，我們利用ChIP-chip技術篩選胃癌中的抑制基因并對其表遺傳學調控機制及抑癌基因功能進行了深入的研究。
　　目的：
　　本研究旨在利用ChIP-chip技術篩選胃癌相關抑制基因，闡明其表遺傳學改

4、變情況，并且利用表遺傳學調控相關藥物進行干預，探討其表遺傳學調控的機制。(1)采用Roche-NimbleGen的Human3×720K RefSeq Promoter Array篩選H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2的基因及H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2的基因。并選取4個候選基因利用ChIP-qPCR實驗驗證ChIP-chip結果。(2)分析3個候選基因在胃癌細胞中的mRNA表

5、達及啟動子區(qū)DNA甲基化狀態(tài)。進一步通過體外實驗研究胃癌細胞株在表遺傳學調控相關藥物的干預下3個候選基因的表達是否可以逆轉，由此探討表遺傳學調控相關藥物在治療胃癌的臨床應用價值。(3)通過體外構建3個候選基因之一的PSD基因表達降低的胃癌細胞株，觀察對其增殖和侵襲能力的影響，進一步論證其抑癌基因功能及作用機制。
　　方法：
　　一、實驗對象
　　2009年4月～2010年6月中國醫(yī)科大學腫瘤研究所行根治性手術治療的胃癌

6、患者癌和癌旁配對組織共40例;人胃癌細胞株SGC7901、MKN45、 BGC823、AGS和永生化正常人胃細胞株GES1。
　　二、實驗方法
　　1、細胞培養(yǎng):GES1、SGC7901、MKN45、BGC823和AGS按常規(guī)培養(yǎng)。DNA甲基化酶抑制劑(5-Aza-2-deoxycytidine)和/或組蛋白去乙?；敢种?TrichostatinA)對胃癌細胞株進行藥物干預及siRNA。
　　2、ChIP-chip技

7、術篩選胃癌相關抑制基因。
　　3、ChIP-qPCR實驗驗證芯片篩選基因結果的可靠性。
　　4、MSP法檢測相關抑制基因啟動子DNA甲基化狀況。
　　5、qRT-PCR檢測相關抑制基因mRNA在細胞和組織水平的表達。
　　6、CCK-8法檢測藥物干預及siRNA前后胃癌細胞增值力的變化。
　　7、細胞劃痕實驗及Transwell侵襲實驗檢測藥物干預及siRNA前后胃癌細胞遷移及侵襲能力的變化。
　　8

8、、Western blot檢測胃癌旁和癌組織中PSD蛋白表達含量。
　　結果：
　　第一部分應用ChIP-chip技術篩選胃癌相關抑制基因的研究
　　ChIP-chip結果顯示134個基因的H3K9Me3 ratio值/H3K9Ac ratio值＞2以及46個基因的H3K9Me3 ratio值/H3K4Me3 ratio值＞2。4個篩選基因進行ChIP-qPCR檢測，結果與芯片分析結果相一致。
　　第二部分胃癌細

9、胞中篩選基因PSD、SMARCC1及Vps37A的表達及其表遺傳學調控機制
　　1、qRT-PCR結果顯示，在胃癌細胞中的篩選基因PSD、SMARCC1表達水平均低于胃正常粘膜上皮細胞。然而，篩選基因Vps37A表達水平在胃癌細胞與胃正常粘膜上皮細胞之間沒有顯著差異。
　　2、MSP結果顯示，在胃癌細胞中的PSD基因DNA啟動子區(qū)表現為甲基化，SMARCC1基因表現為部分甲基化。然而，Vps37A基因表達為非甲基化。

10、　　3、表遺傳學調控相關藥物（5-Aza-2-deoxycytidine、Trichostatin A）對胃癌細胞MKN45細胞的增殖、遷徙及侵襲能力有明顯影響。并且可以逆轉PSD、SMARCC1基因DNA啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)，從而恢復PSD、SMARCC1基因mRNA的表達。但對Vps37A基因mRNA的的表達無明顯影響。
　　第三部分 PSD基因抑癌作用機制的探討以及其臨床意義
　　1、胃癌細胞中PSD基因表達水平明顯低

11、于GES1細胞，DNA甲基化及異常組蛋白修飾共同調控PSD基因表達。
　　2、篩選PSD相對高表達的胃癌細胞株SGC7901采用siRNA技術下調其表達后，胃癌細胞株SGC7901的增殖力、侵襲力均明顯增強。
　　3、下調PSD基因表達后，胃癌細胞SGC7901的細胞增殖、遷徙及侵襲能力明顯提高。
　　4、檢測篩選基因調控的細胞因子（Caspase3、Caspase7）的蛋白表達水平在轉染后明顯下調。
　　5、胃

12、癌組織中PSD基因mRNA及蛋白表達水平明顯低于癌旁組織，并與腫瘤分化及淋巴結轉移相關，但未發(fā)現與其他臨床病理學特征具有相關性。
　　結論：
　　1、啟動子芯片結合芯片技術(ChIP-chip)可以高通量的篩選胃癌中受表遺傳學機制調控的抑癌基因。
　　2、在胃癌細胞中，抑癌基因PSD、SMARCC1的表達下調是組蛋白修飾和DNA甲基化共同作用的結果。
　　3、PSD基因在胃癌中起到抑癌基因功能，其作用機制可能與誘