CHIP降解tau蛋白特性研究.pdf

1、第一部分 CHIP降解tau蛋白特性研究 神經(jīng)原纖維纏結(NFTs)是阿爾茨海默病典型的腦病理特征之一，構成NFTs的主要成分是異常磷酸化的tau蛋白。最近研究發(fā)現(xiàn)：CHIP(carboxylterminusofHsc70-interactingprotein)是tau蛋白特異性的泛素連接酶3。在體外，CHIP可以促進tau蛋白的降解。但在體CHIP降解tau蛋白的特性還不清楚。另外，CHIP介導tau蛋白泛素化的方式目

2、前還存在爭議。在我們的研究中，用立體定位注射技術將CHIP質粒導入大鼠雙側海馬來研究CHIP對tau蛋白的降解特性。在CHIP質粒注射后，在24小時內CHIPmRNA和蛋白表達水平都呈時間依賴性的顯著升高。同時，CHIP質粒轉染鼠腦中總tau蛋白以及在PHF-1位點磷酸化和在tau-1位點非磷酸化的tau蛋白水平均顯著下降，且這種下降和CHIP的增加負相關。CHIP蛋白表達增加并不影響tau蛋白的mRNA水平和蛋白酶小體的活性。以上結果

3、提示在正常大鼠腦內CHIP可以調節(jié)tau蛋白的降解且不依賴與tau蛋白的磷酸化狀態(tài)。我們進一步檢測CHIP能否降解異常磷酸化的tau蛋白。通過側腦室注射wortmannin和GFX來復制tau蛋白磷酸化的動物模型。我們發(fā)現(xiàn)和模型組相比，在CHIP過表達的鼠腦內，在PHF-1位點過度磷酸化的tau蛋白水平顯著下降，而CHIP并不抑制wortmannin/GFX誘導的GSK-3β的激活。以上結果提示：在鼠腦內CHIP過量表達可以促進異常磷酸

4、化tau蛋白的降解。用激酶GSK3β的激活劑wortmannin或酯酶抑制劑崗田酸(OA)處理N2a細胞以誘導AD樣tau蛋白磷酸化的細胞模型，同時在N2a細胞瞬時轉染CHIP質粒，免疫熒光結果顯示過量表達CHIP可以降低tau蛋白在pS214和pS396位點的磷酸化水平并顯著抑制磷酸化tau蛋白的聚積。以上結果提示過量表達CHIP可以促進異常磷酸化tau蛋白的降解。免疫共沉淀發(fā)現(xiàn)tau蛋白、Hsc70和CHIP二聚體共存。為確定在CH

5、IP和tau蛋白的相互作用中是否需要Hsc70，我們首先將大鼠海馬勻漿液用結果發(fā)現(xiàn)：用Hsc70抗體進行免疫沉淀去除Hsc70后，再用tau蛋白的抗體進行免疫沉淀仍然可以觀察到tau蛋白和CHIP二聚體復合物。以上結果提示在沒有Hsc70的情況下，CHIP二聚體仍可和tau蛋白直接相互作用。CHIP二聚體可能通過一種新的非Hsc70依賴的方式來發(fā)揮其作用。氯化鋰可以在細胞水平上調CHIP蛋白的表達?？傊覀兊慕Y果首次提供在體證據(jù)：二聚

6、體CHIP在生理和病理條件下對tau蛋白的降解都是很關鍵的，二聚體CHIP可能通過非Hsc70依賴性的方式發(fā)揮作用。過表達CHIP可能是抑制NFTs形成的潛在治療手段之一。 第二部分一氧化氮通過激活GSK-3β誘導tau蛋白磷酸化 AD病人腦內的典型病理特征之一是神經(jīng)原纖維纏結(NFTs)，其主要是由異常磷酸化的tau蛋白組成。在NFTs中，可檢測到一氧化氮(Nitricoxide，NO)的存在。但是NO與tau蛋白磷酸

7、化的關系尚不清楚。我們的研究發(fā)現(xiàn)：由廣泛應用的NO的供體硝普鈉(odiumnitroprusside，SNP)產(chǎn)生的NO，在HEK293/tau441細胞中可以誘導tau蛋白在Ser396/404andSer262位點發(fā)生磷酸化，同時可檢測到糖原合酶激酶(glycogensynthasekinase-3β，.GSK-3β)的激活。在SNP處理細胞前用GSK-3的抑制劑10mM的氯化鋰(lithiumchlorideLiCl)預處理1個小

8、時，則可以抑制由SNP誘導的tau蛋白的磷酸化改變和GSK-3β的激活。本實驗首次證明在體外NO可以誘導AD樣tau蛋白磷酸化，GSK-3β的激活是NO誘導tau蛋白磷酸化的機制之一。NO可能是在AD病人腦內導致tau蛋白磷酸化的上游因子。 第三部分 大鼠皮質雙向電泳樣品制備方法的優(yōu)化 目的優(yōu)化大鼠皮質雙向電泳樣品制備方法，初步建立雙向電泳條件，提高電分辨率和重復性。方法分別應用三氯乙酸/丙酮沉淀法、超速離心法及