利用RNAi技術(shù)鑒定SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)增殖的關(guān)鍵因子.pdf

1、南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus,SRBSDV）是呼腸孤病毒科（Reoviridae）斐濟病毒屬（Fijivirus）的一個暫定種，由介體昆蟲白背飛虱（Sogatella furcifera）以持久增殖型方式傳播，但不經(jīng)卵傳播。由SRBSDV引發(fā)的南方水稻黑條矮縮病在我國南方稻區(qū)以及越南稻區(qū)等地暴發(fā)流行給水稻生產(chǎn)造成了嚴重的損失。病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白對于病毒在介體昆蟲

2、體內(nèi)的運動、復(fù)制和裝配等起著重要作用。SRBSDV編碼的P5-1、P6和P9-1蛋白是病毒原質(zhì)的組分，參與病毒的復(fù)制和裝配。但是同為病毒原質(zhì)的組分，P5-1、P6和P9-1各自在病毒原質(zhì)和病毒復(fù)制中起著什么作用還沒有明確。RNAi技術(shù)是近年來研究基因功能的一個重要技術(shù)手段，利用RNAi技術(shù)進行植物病毒病的防治已成為重要的手段。因此，本研究擬利用RNAi技術(shù)鑒定SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)復(fù)制起始的關(guān)鍵基因，為病毒病的防控提供一個高效靶標基

3、因。
　　本實驗首先擴增SRBSDV-P5-1 N-端1-750 bp基因片段，通過Gateway體系構(gòu)建原核表達載體，特異性誘導表達目的蛋白條帶后注射新西蘭大白兔制備多克隆抗體，Western blot和免疫熒光標記技術(shù)的檢測結(jié)果表明，本實驗所制備的多克隆抗體能特異性檢測SRBSDV侵染水稻和白背飛虱表達的P5-1蛋白，表明本實驗所制備P5-1多克隆抗體具有較好的特異性。以SRBSDV病毒原質(zhì)組分P5-1、P6和P9-1蛋白為研

4、究對象，利用T7轉(zhuǎn)錄酶體外合成其雙鏈RNA（double-stand RNA, dsRNA），利用顯微注射法將濃度約為0.5μg/μL的dsRNA導入飼毒2 d的白背飛虱體內(nèi)，同時以注射dsGFP的處理為對照。注射后6 d用相關(guān)蛋白的熒光抗體進行免疫熒光標記，共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，分別干擾P5-1、P6和P9-1基因表達后，均能明顯抑制相關(guān)基因P5-1、P6、P9-1、P7-1和P10在白背飛虱體內(nèi)的表達，且病毒被限制在初侵染的中腸上皮

5、細胞中，沒有發(fā)生擴散。抑制P5-1蛋白表達后，P6和P9-1蛋白仍可表達，但僅限于在初侵染細胞中表達，P7-1和P10蛋白表達受到明顯抑制，認為 P5-1作為與病毒粒體裝配有關(guān)的蛋白，其調(diào)控著外殼蛋白和擴散相關(guān)蛋白的表達，從而阻礙了病毒在白背飛虱體內(nèi)的裝配和擴散。干擾P6蛋白的表達后，84％的昆蟲體內(nèi)檢測不到P6蛋白，同時也檢測不到P5-1、P9-1、P7-1和P10蛋白，但在16%的昆蟲上皮細胞內(nèi)可檢測到P6蛋白，此時也可檢測到P5-

6、1、P9-1、P7-1和P10蛋白，表明P6蛋白不表達則不能啟動病毒的增殖，一旦P6蛋白有少量的表達則啟動病毒在上皮細胞內(nèi)的增殖。抑制P9-1蛋白的表達后，P6蛋白仍可表達，但也僅局限在初侵染的上皮細胞內(nèi)，而P5-1蛋白的表達受到抑制，同時P7-1和P10蛋白的表達也受到明顯抑制，表明參與病毒基因組復(fù)制的P9-1蛋白表達受抑制后，參與病毒裝配的P5-1蛋白和外殼蛋白P10的表達受到抑制，同時由于病毒無法裝配，使管狀結(jié)構(gòu)蛋白P7-1表達受

7、到抑制。此外，本實驗通過RT-qPCR檢測了dsRNA對病毒增殖的影響，發(fā)現(xiàn)干擾P5-1、P6和P9-1基因的表達后，編碼病毒外殼蛋白的P10基因拷貝數(shù)相對處理組明顯下降，表明病毒在白背飛虱體內(nèi)的復(fù)制和增殖受到阻礙。Western blot檢測也發(fā)現(xiàn)分別抑制P5-1、P6和P9-1蛋白的表達后，能明顯抑制其它相關(guān)蛋白的表達。其中抑制P5-1蛋白表達后，能檢測P6和P9-1蛋白能有少量表達，P10幾乎沒有表達，干擾P6表達后，均沒有檢測到

8、相關(guān)蛋白的表達；抑制P9-1蛋白表達后，P6蛋白有少量表達，其余相關(guān)蛋白均沒有檢測到。
　　綜上所述，本研究通過dsRNA誘導的RNAi技術(shù)，明確了P5-1、P6和P9-1均是 SRBSDV在昆蟲體內(nèi)增殖的重要蛋白，抑制單個基因的表達均能明顯抑制病毒在介體昆蟲體內(nèi)的復(fù)制和擴散。P6蛋白在病毒增殖中起最關(guān)鍵的作用，負責啟動病毒在初侵染上皮細胞內(nèi)的增殖，抑制P6蛋白的表達則抑制病毒所有蛋白的表達；P9-1蛋白作為病毒基因組復(fù)制的場所，