SRBSDV和RRSV在介體飛虱體內(nèi)的侵染機(jī)理.pdf

1、近年來(lái)由南方水稻黑條矮縮病毒（Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV）引起的南方水稻黑條矮縮病在我國(guó)南方稻區(qū)暴發(fā)流行，已成為我國(guó)目前水稻（Oryza sativa）生產(chǎn)上的重要病害之一。同時(shí)由水稻齒葉矮縮病毒（Rice ragged stunt virus, RRSV）引起的水稻齒葉矮縮病也在我國(guó)南方稻區(qū)蔓延發(fā)生。SRBSDV是一種新發(fā)現(xiàn)的水稻病毒，屬于呼腸孤病毒科（Reovir

2、idae）斐濟(jì)病毒屬（Fijivirus）的一個(gè)暫定種，由新的介體白背飛虱（Sogatella furcifera）以持久增殖型方式傳播。RRSV是一種再次發(fā)生的老病毒，是呼腸孤病毒科（Reoviridae）水稻病毒屬（Oryzavirus）的代表種，由介體褐飛虱（Nilaparvata lugens）以持久增殖型方式傳播。目前，國(guó)內(nèi)的科研工作者已對(duì)這兩種水稻病毒的介體傳毒特性做了大量的研究，然而關(guān)于病毒在介體飛虱體內(nèi)的侵染機(jī)理知之甚少

3、，有關(guān)病毒在介體體內(nèi)的侵染循回過(guò)程以及復(fù)制和擴(kuò)散機(jī)理還未曾報(bào)道。
　　本研究首先通過(guò)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)系統(tǒng)研究了 SRBSDV在其介體昆蟲體內(nèi)的侵染循回過(guò)程。明確了 SRBSDV在白背飛虱取食過(guò)程中首先進(jìn)入中腸腸腔；隨后少量的病毒粒體侵入中腸上皮細(xì)胞并進(jìn)行復(fù)制；增殖后的病毒從中腸上皮細(xì)胞向中腸表面的肌肉組織擴(kuò)散；病毒在中腸表面沿著環(huán)肌和縱肌向鄰近的器官擴(kuò)散；飼毒后6 d，部分白背飛虱體內(nèi)SRBSDV已通過(guò)血淋巴擴(kuò)散到唾液腺；飼毒后8

4、 d，病毒在白背飛虱唾液腺中大量增殖，達(dá)到了系統(tǒng)性侵染，從而完成了整個(gè)侵染循回過(guò)程。SRBSDV與白背飛虱和灰飛虱的親和性具有明顯的差別，這可能與病毒在兩種介體體內(nèi)的侵染循回過(guò)程不同有關(guān)。通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察SRBSDV在飼毒后25 d的灰飛虱消化系統(tǒng)的分布，發(fā)現(xiàn)灰飛虱的中腸內(nèi)可以檢測(cè)到病毒，但在唾液腺中檢測(cè)不到病毒，明確了 SRBSDV受到中腸釋放屏障的阻礙無(wú)法擴(kuò)散到唾液腺，從而不能被灰飛虱有效傳播。
　　SRBSDV在介體昆蟲

5、內(nèi)的侵染會(huì)誘導(dǎo)形成提供病毒復(fù)制和裝配場(chǎng)所的球狀或纖維狀的電子致密內(nèi)含體——病毒原質(zhì)（viroplasm）。為進(jìn)一步研究 SRBSDV在介體昆蟲體內(nèi)的侵染和增殖機(jī)制，本研究在 SRBSDV侵染的白背飛虱培養(yǎng)細(xì)胞中觀察到病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白 P9-1分布在病毒原質(zhì)基質(zhì)中。子代病毒粒體和病毒復(fù)制產(chǎn)生的病毒RNA積累在P9-1分布的病毒原質(zhì)基質(zhì)中。在體外體系中， SRBSDV P9-1可獨(dú)立形成類似于病毒原質(zhì)基質(zhì)的內(nèi)含體。這些結(jié)果表明， SRB

6、SDV P9-1是形成病毒原質(zhì)基質(zhì)的必需組分，形成的病毒原質(zhì)是SRBSDV進(jìn)行病毒RNA復(fù)制和病毒粒體裝配的場(chǎng)所。為了進(jìn)一步驗(yàn)證SRBSDV P9-1在病毒侵染介體過(guò)程中的功能，本研究首次將人工合成dsRNA誘導(dǎo)的RNAi技術(shù)與白背飛虱培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)相結(jié)合研究P9-1的功能。通過(guò)轉(zhuǎn)染針對(duì)P9-1基因的人工合成的dsRNA干擾P9-1基因在介體培養(yǎng)細(xì)胞中的表達(dá)顯著抑制病毒原質(zhì)的形成和病毒在細(xì)胞中的侵染。將人工合成的P9-1基因dsRNA通過(guò)

7、膜飼喂法飼喂白背飛虱，抑制了 SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的侵染和復(fù)制，從而阻礙了白背飛虱傳播病毒。因此，SRBSDV P9-1是病毒在介體昆蟲體內(nèi)有效侵染和復(fù)制所必需的。
　　SRBSDV侵染白背飛虱后必須從初侵染的中腸上皮細(xì)胞擴(kuò)散到唾液腺才能被介體有效傳播，因此病毒在介體內(nèi)的擴(kuò)散也是其完成侵染循回的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本研究在SRBSDV侵染的白背飛虱培養(yǎng)細(xì)胞中觀察到由非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1形成的包裹著病毒粒體的管狀結(jié)構(gòu)可伸出侵染細(xì)胞的表面。

8、在體外實(shí)驗(yàn)中，單獨(dú)表達(dá)的P7-1能在Sf9細(xì)胞中形成伸出細(xì)胞的小管結(jié)構(gòu)，推測(cè)其參與病毒在介體昆蟲體內(nèi)的擴(kuò)散。為了驗(yàn)證 P7-1蛋白在病毒擴(kuò)散過(guò)程中的作用，本研究通過(guò)病毒抗體中和培養(yǎng)細(xì)胞中游離病毒粒體后，仍可觀察到 P7-1管狀結(jié)構(gòu)從初次侵染的細(xì)胞延伸到鄰近的健康細(xì)胞。體外轉(zhuǎn)染人工合成的針對(duì) P7-1基因的 dsRNA有效抑制P7-1管狀結(jié)構(gòu)的形成，阻礙 SRBSDV在細(xì)胞間的擴(kuò)散，表明 P7-1管狀結(jié)構(gòu)是SRBSDV在白背飛虱培養(yǎng)細(xì)胞間

9、安全擴(kuò)散的重要通道。
　　P7-1管狀結(jié)構(gòu)是否介導(dǎo)病毒在白背飛虱體內(nèi)擴(kuò)散？通過(guò)免疫熒光標(biāo)記分析發(fā)現(xiàn)P7-1管狀結(jié)構(gòu)在白背飛虱體內(nèi)的擴(kuò)散途徑與病毒的侵染循回過(guò)程一致，P7-1管狀結(jié)構(gòu)從白背飛虱中腸上皮細(xì)胞首先擴(kuò)散到中腸表面的環(huán)肌，并沿著環(huán)肌橫向擴(kuò)散，當(dāng)遇到與環(huán)肌交叉的縱肌后開(kāi)始沿著縱肌縱向擴(kuò)散，最后擴(kuò)散到整個(gè)中腸和鄰近器官的表面。在 P7-1管狀結(jié)構(gòu)到達(dá)的部位病毒才能進(jìn)行復(fù)制，病毒的復(fù)制滯后于 P7-1管狀結(jié)構(gòu)的擴(kuò)散。通過(guò)酵母雙雜交

10、系統(tǒng)和免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)P7-1與肌動(dòng)蛋白（Actin）存在特異性互作。因此，P7-1管狀結(jié)構(gòu)具備了在消化道外層肌纖維上運(yùn)動(dòng)的能力。通過(guò)膜飼喂法飼喂人工合成的針對(duì) P7-1基因的dsRNA，有效抑制 P7-1管狀結(jié)構(gòu)的形成，阻礙病毒在白背飛虱體內(nèi)的擴(kuò)散，最終阻礙了白背飛虱傳播SRBSDV的能力，表明SRBSDV P7-1是病毒在白背飛虱體內(nèi)有效擴(kuò)散所必需的。
　　本研究對(duì) RRSV在其介體褐飛虱體內(nèi)的侵染循回過(guò)程和復(fù)制機(jī)理進(jìn)行了分

11、析。首先通過(guò)免疫熒光標(biāo)記技術(shù)明確了 RRSV在褐飛虱體內(nèi)的侵染循回途徑與SRBSDV在白背飛虱體內(nèi)的侵染循回途徑大體相似。在病毒侵染褐飛虱過(guò)程中，由非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10誘導(dǎo)形成的病毒原質(zhì)在中腸上皮細(xì)胞、中腸外層肌肉組織和唾液腺等組織均有分布。通過(guò)膜飼喂體外合成的針對(duì)Pns10基因的dsRNA抑制了病毒原質(zhì)在介體昆蟲體內(nèi)的形成，阻礙病毒在褐飛虱體內(nèi)的侵染和復(fù)制，證明了Pns10蛋白是RRSV侵染介體褐飛虱所必需的。
　　綜上所述，本

12、研究首次闡明了SRBSDV和RRSV在不同飛虱體內(nèi)的侵染循回過(guò)程；首次將RNAi技術(shù)與介體昆蟲培養(yǎng)細(xì)胞相結(jié)合研究植物病毒編碼蛋白的功能，明確了SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P9-1和RRSV非結(jié)構(gòu)蛋白Pns10是形成病毒原質(zhì)基質(zhì)的組分，參與病毒在介體內(nèi)的復(fù)制，SRBSDV非結(jié)構(gòu)蛋白P7-1蛋白是形成包裹病毒粒體的管狀結(jié)構(gòu)的組分，參與病毒在介體內(nèi)的擴(kuò)散。初步解析了SRBSDV和RRSV適應(yīng)于相應(yīng)介體昆蟲高效傳毒的分子機(jī)制，為利用RNAi原理培育轉(zhuǎn)