不同組分固定液對(duì)組織保存效果影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　在組織處理過(guò)程中，組織的固定至關(guān)重要。在過(guò)去的一百年中甲醛是國(guó)際上通用的組織固定液，但是用甲醛固定組織主要存在以下缺點(diǎn)：①易揮發(fā)，有毒。②易引起組織內(nèi)形成廣泛的蛋白質(zhì)交聯(lián)，影響免疫組織化學(xué)染色中抗原決定簇的暴露。③易導(dǎo)致DNA斷裂，交聯(lián)作用阻礙核酸的提取并局限了DNA片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展及疾病相關(guān)基因研究的不斷深入，分子病理學(xué)檢測(cè)已成為病理診斷的重要輔助手段。在形態(tài)學(xué)、免

2、疫組織化學(xué)、相關(guān)遺傳物質(zhì)保存等方面優(yōu)于甲醛的綠色環(huán)保固定液成為研究熱點(diǎn)。
　　研究目的：
　　探討不同成份固定液對(duì)組織形態(tài)學(xué)的保存、組織化學(xué)、免疫組織化學(xué)染色以及對(duì)提取組織DNA片段長(zhǎng)度完整性的影響。
　　研究方法：
　　1.固定液的配制：本實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配制三種無(wú)醛固定液：①R固定液（以RCL-2固定液主要成分為參考）；②U固定液（以UMFIX固定液主要成分為參考）③W固定液(以Weigners fixative主要

3、成分為參考)，④對(duì)照固定液F（4％中性甲醛固定液）。
　　2.標(biāo)本收集：收集外科手術(shù)送檢的新鮮標(biāo)本48例：胃癌9例，直腸癌5例，肺癌6例，正常甲狀腺10例，正常乳腺10例，子宮肌瘤8例。按照《臨床技術(shù)操作規(guī)范（病理學(xué)分冊(cè)）》的要求，腫瘤標(biāo)本選取正常組織與腫瘤組織交界，正常標(biāo)本選取正常組織分別切取2cm×1.5cm，厚度為3mm的組織塊4塊，裝入包埋盒中，分別置于固定液R、固定液U、固定液W、以及4%中性甲醛固定液（F）中，于室溫下

4、固定12小時(shí)，常規(guī)脫水，石蠟包埋。3μm連續(xù)切片粘附于載玻片，用于HE染色，形態(tài)學(xué)觀察。6μm連續(xù)切片5片存于1.5ml的Eppendorf管中用于DNA提取，PCR擴(kuò)增，GAPDH基因檢測(cè)。
　　3.組織形態(tài)學(xué)評(píng)判：切片進(jìn)行 HE染色，從整體形態(tài)、整體染色、核染色、細(xì)胞輪廓、紅細(xì)胞的完整性、細(xì)胞質(zhì)染色等6個(gè)方面給出評(píng)分，并比較不同組分固定液對(duì)組織形態(tài)學(xué)的保存效果的影響。
　　4.組織化學(xué)染色（特殊染色）：PAS染色比較不同

5、組分固定液對(duì)中性黏蛋白保存效果；MASSON三色染色、網(wǎng)狀纖維染色和彈力纖維染色比較不同組分固定液對(duì)纖維結(jié)締組織的保存效果和染色效果的影響。
　　5.免疫組織化學(xué)染色：CK、EMA、SMA、Desmin、P63、34βE12、TTF-1、Cadherin-E、CK7染色、評(píng)分，并比較不同組分固定液對(duì)抗原保存效果的影響。
　　6.基因組DNA提取及驗(yàn)證：行OD260及OD260/OD280對(duì)提取的DNA濃度、純度、完整性進(jìn)行檢

6、測(cè)及GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳，觀察PCR產(chǎn)物擴(kuò)增的效果，評(píng)估其模板的完整性來(lái)比較不同組分固定液對(duì) DNA保存效果的影響。
　　結(jié)果:
　　1.組織形態(tài)學(xué)染色：整體形態(tài)和整體染色及核染色上，R組獲得了最高分?jǐn)?shù)（整體形態(tài)得分：3.44；整體染色得分：3.45；核染色得分：3.25）；F組獲得了最高的細(xì)胞輪廓得分（3.26）和最高的紅細(xì)胞完整性得分（3.31）；W組得分最低，與其他三組差異明顯（P<0.05）。<

7、br>　　2.組織化學(xué)染色：
　　胃組織PAS染色中：F組PAS染色中陽(yáng)性物質(zhì)呈現(xiàn)很強(qiáng)的紫紅色；R組陽(yáng)性物質(zhì)有溶解的跡象出現(xiàn)，而且在細(xì)胞內(nèi)的分布有偏向細(xì)胞一極聚集的現(xiàn)象發(fā)生；U組染色色彩鮮艷；W組陽(yáng)性物質(zhì)著色暗淡。
　　甲狀腺膠質(zhì)在PAS染色中：F組染色暗淡；R組和W組膠質(zhì)收縮明顯；U組呈現(xiàn)均質(zhì)狀。
　　Masson染色中：U組和R組顏色深而鮮亮，肌纖維的紅色著色和膠原纖維的綠色著色對(duì)比鮮明，F(xiàn)組和W組染色暗淡，各種纖

8、維染色對(duì)比不明顯。
　　彈力纖維染色：F組和U組彈力纖維著色清晰，背景干凈；而R組和W組彈力纖維分布雜亂，斷裂，染色背景相對(duì)模糊。
　　網(wǎng)狀纖維染色：R組背景干凈，網(wǎng)狀纖維顯示清晰；F組出現(xiàn)過(guò)染現(xiàn)象；U組染色較差，網(wǎng)狀纖維難以辨認(rèn)；W組背景染色較深，僅顯示出少量的網(wǎng)狀纖維。
　　3.免疫組織化學(xué)染色：
　?、貱K、EMA、SMA、Desmin、P63、34βE12、TTF-1：F組與R組各指標(biāo)得分無(wú)明顯差異,與U

9、組及W組顯著性差異（P<0.05）。
　?、贑adherin-E：F組和R組、U組、W組得分有顯著性差異（P<0.05）；
　?、跜K7：F組和U組及R組得分在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無(wú)明顯差異（P>0.05），F(xiàn)組和W組的差異明顯（P<0.05）。
　　4.抽提的組織基因組DNA含量：R組DNA含量最高（OD260=0.029）（P<0.05），依次為U（OD260=0.025）、W（OD260=0.021）、F（OD260=0.0

10、20）；OD260/OD280比值均沒(méi)有明顯差異（P＞0.05）。
　　5.GAPDH基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳：
　　①乳腺組織：R組、U組均有明顯的目的DNA擴(kuò)增條帶，W組目的條帶不清晰，F(xiàn)組幾乎沒(méi)有目的條帶；
　?、诩谞钕俳M織：R組、U組、F組均能看到清晰目的條帶，F(xiàn)組出率較低；W組沒(méi)有目的條帶；
　?、畚附M織：R組、W組均有清晰目的條帶，F(xiàn)組目的條帶比較模糊，U組幾乎沒(méi)有目的條帶；
　?、苣c組

11、織： R組、U組、W組目的條帶清晰可見，F(xiàn)組目的條帶很淡；
　?、葑訉m組織：R組、U組都能看到清晰的目的條帶，W組條帶比較模糊，F(xiàn)組幾乎沒(méi)有目的條帶；
　?、薹谓M織：R組能看到清晰的目的條帶，U組次之，U組條帶比較弱，W組目的條帶不清晰且雜亂，F(xiàn)組目的條帶出率很低。
　　結(jié)論：
　　1、甲醛仍是形態(tài)學(xué)保存效果最好的固定劑。
　　2、甲醛固定液和U固定液對(duì)糖類和彈力纖維的保護(hù)能力較好，而在網(wǎng)狀纖維保護(hù)方面，R