HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列的功能研究及其在核酸疫苗中的應(yīng)用.pdf

1、HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列(HPRE)是乙肝病毒(HBV)基因組中在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)HBV基因表達(dá)的調(diào)控序列，廣泛存在的細(xì)胞核因子即HPRE結(jié)合蛋白與該序列結(jié)合能促進(jìn)mRNA向細(xì)胞核外轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)病毒基因的復(fù)制和表達(dá)，同時(shí)，由某些細(xì)胞因子誘導(dǎo)產(chǎn)生的HPRE抑制性結(jié)合蛋白與該序列某些位置結(jié)合，抑制此環(huán)節(jié)，從而阻礙病毒基因的復(fù)制和表達(dá)。 豬囊蟲(chóng)是豬帶絳蟲(chóng)的幼蟲(chóng)，在人體內(nèi)寄生可引起囊蟲(chóng)病。有關(guān)豬囊蟲(chóng)病疫苗的研制有許多方法，包括蟲(chóng)體來(lái)源的天然

2、抗原或重組抗原，蛋白亞單位疫苗，以及核酸疫苗。90年代發(fā)展起來(lái)的核酸疫苗具有能夠激發(fā)機(jī)體全面免疫發(fā)應(yīng)、不散毒、便于儲(chǔ)存和運(yùn)輸?shù)葍?yōu)點(diǎn)，具有潛在的應(yīng)用價(jià)值，但其潛在的危險(xiǎn)性也是關(guān)注的焦點(diǎn)。已有研究證明以豬囊蟲(chóng)共同抗原基因制備的核酸疫苗具有良好的保護(hù)率。 本研究首先以熒光素酶(luciferase，LUC)基因?yàn)閳?bào)告基因，將HBV轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)序列(HPRE)以及缺失不同功能區(qū)域的HPRE片段插入報(bào)告基因下游，構(gòu)建以下真核表達(dá)質(zhì)粒： pc

3、DNA3.0-luc、pcDNA3.0-luc-HPRE、 pcDNA3.0-luc-HPREβ<,1>β<,2>、pcDNA3.0-luc-HPREαβ<,2>及pcDNA3.0-luc-HPREαβ<,1>，轉(zhuǎn)染真核細(xì)胞，以重組人IFN-α作為誘導(dǎo)產(chǎn)生HPRE抑制性結(jié)合蛋白的刺激因子，在IFN-α作用前后，熒光素酶檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)熒光素酶活性的變化。發(fā)現(xiàn)缺失功能區(qū)域β<,2>后，IFN-α作用前后的熒光素酶活性變化不明顯，說(shuō)明HPRE抑

4、制性結(jié)合蛋白主要與β<,2>發(fā)生作用。 在搞清楚HPRE抑制性結(jié)核蛋白結(jié)合區(qū)域后，將不含此區(qū)域的HPRE片段插入豬囊蟲(chóng)核酸疫苗pPCV中，構(gòu)建核酸疫苗pPCV-HP，免疫小鼠，測(cè)抗體滴度，并于兩周后用豬絳蟲(chóng)卵攻擊，三個(gè)月后解剖觀察豬囊尾蚴數(shù)，結(jié)果顯示核酸疫苗pPCV-HP的抗體滴度高于核酸疫苗pPCV，其保護(hù)率也比核酸疫苗pPCV的保護(hù)率高8％。采集豬各組織和豬舍環(huán)境中的糞便及土壤樣品，提取各組織的總DNA和卡那抗性菌的質(zhì)粒，P