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文檔簡介
1、前言:核仁素是一種重要的RNA結(jié)合蛋白,參與核糖體RNA的轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)運(yùn)和核糖體亞基組裝的調(diào)節(jié)。近期大量研究表明核仁素通過蛋白質(zhì)-RNA結(jié)合方式參與多個基因mRNA穩(wěn)定性的調(diào)節(jié),這些靶mRNA分子包括:Bcl-2、P53、GADD45、IL-2等。
我室以往的實(shí)驗(yàn)表明核仁素參與VEGF介導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管型形成;而且核仁素心肌特異性表達(dá)可促進(jìn)小鼠缺血區(qū)心肌血管新生。上述結(jié)果提示,核仁素在血管新生調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用,而且核仁素亦
2、可能在心肌細(xì)胞中調(diào)節(jié)血管新生相關(guān)因子的表達(dá),促進(jìn)其分泌,進(jìn)而調(diào)節(jié)血管新生過程。然而其具體機(jī)制是否與核仁素介導(dǎo)某些血管新生相關(guān)基因mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)有關(guān),目前尚不清楚。
方法:本研究首先采用生物信息學(xué)分析了多個人類血管新生相關(guān)基因的mRNA序列以篩選核仁素可能結(jié)合的mRNA靶分子。隨后以培養(yǎng)的大鼠心肌細(xì)胞H9C2和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC為模型,采用蛋白質(zhì)-RNA免疫共沉淀結(jié)合定量PCR技術(shù)分別證實(shí)上述潛在靶分子與核仁素的相
3、互作用,并進(jìn)一步通過基因轉(zhuǎn)染方式上調(diào)或下調(diào)核仁素蛋白表達(dá)策略,采用定量PCR技術(shù)分析核仁素對上述靶基因mRNA表達(dá)以及mRNA穩(wěn)定性的影響。最后建立以核仁素心肌特異性表達(dá)的小鼠心肌缺血模型,采用RNA-IP-PCR組合技術(shù)驗(yàn)證上述靶mRNA分子與核仁素的相互作用。通過本研究以期在轉(zhuǎn)錄后水平闡明核仁素對血管新生過程中的可能調(diào)控機(jī)制,為血管新生調(diào)控研究提供新的思路和視野。
結(jié)果:
1.通過生物信息學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)MMP9、V
4、EGF、hETS1、VE-Cadherin、KDR、Tie-2、MMP2等多個血管新生相關(guān)基因mRNA的3'-UTR或5'-UTR或編碼區(qū)含有數(shù)量不等的核仁素結(jié)合元件“(T/G)CCCG(A/G)”序列。
2.采用蛋白質(zhì)-RNA免疫共沉淀技術(shù)結(jié)和Real-time PCR分析核仁素過表達(dá)的H9C2細(xì)胞發(fā)現(xiàn),上述潛在的核仁素結(jié)合靶分子中僅有MMP9和VEGF與核仁素蛋白具有相互作用。然而,在HUVEC細(xì)胞中發(fā)現(xiàn),VE-cadhe
5、rin、Endoglin、hETS1、Angiopoietin與核仁素蛋白具有相互作用。同時發(fā)現(xiàn)核仁素過表達(dá)時,兩種細(xì)胞中具有相互作用的靶基因mRNA表達(dá)升高,相反,核仁素低表達(dá)時,其表達(dá)則降低。
3.進(jìn)一步采用放線菌素D阻斷心肌細(xì)胞H9C2基因轉(zhuǎn)錄后,觀察已合成mRNA的降解速率發(fā)現(xiàn),核仁素過表達(dá)可以提高M(jìn)MP9基因mRNA的穩(wěn)定性,抑制其降解,而核仁素低表達(dá)則抑制MMP9基因mRNA的穩(wěn)定性,加速其降解。
4.為
6、進(jìn)一步證明上述相互作用,本研究采用蛋白質(zhì)-RNA免疫沉淀分析核仁素特異性轉(zhuǎn)基因小鼠缺血心肌組織發(fā)現(xiàn)核仁素與MMP9的mRNA存在相互結(jié)合。
結(jié)論:
1.核仁素的促血管新生作用機(jī)制可能與核仁素與相關(guān)基因VEGF、MMP9、VE-cadherin、Endoglin、ETS1、和Angiopoietin的mRNA結(jié)合,通過影響其mRNA的穩(wěn)定性,從而調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平有關(guān)。
2.核仁素通過調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞MMP9
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