赤霉菌基因改造用于工程化組合產(chǎn)生紫杉烷類化合物的基礎(chǔ)研究.pdf

1、紫杉醇(paclitaxel，商品名Taxol)是首先從太平洋紅豆杉樹(shù)皮中分離得到的有效抗腫瘤藥物，屬于紫杉烷二萜類化合物。在紫杉醇的生物合成途徑中第一個(gè)重要的中間體是紫杉烯(taxa—4(5)，11(12)—diene)，它是由牻牛兒基牻牛兒基二磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGDP)在紫杉烯合酶(Taxadiene Synthase，TS)催化下環(huán)化而成。GGPP也是赤霉素等的生物合成前體，本論文以赤霉

2、素產(chǎn)生菌赤霉菌(Gibberella fujkuroi)為實(shí)驗(yàn)材料，開(kāi)展了與紫杉醇合成生物學(xué)相關(guān)的研究和探索。
　　 1.赤霉菌GGPP合酶基因的克隆
　　 以赤霉菌為材料，提取總RNA，根據(jù)GenBank的有關(guān)信息設(shè)計(jì)并合成引物，RT—PCR.方法獲得赤霉菌GGPP合酶基因(cDNA)，并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。
　　 2.紫杉醇生物合成基因雙元表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 在本室現(xiàn)有載體的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了含有紫杉烯合酶(

3、TS)基因及潮霉素抗性(HmBr)基因的雙元表達(dá)載體pAN—7—1/AN7112/TS/HmB。
　　 3.赤霉菌貝殼杉烯合酶(CPS/KS)基因取代載體的構(gòu)建
　　 在本室現(xiàn)有的含有赤霉菌貝殼杉烯合酶(CPS/KS)基因的克隆載體pMD3036FM的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了cps/ks基因取代載體pMD3036FM(e)HmB等，該載體含有來(lái)自貝殼杉烯合酶基因序列的同源交換臂以及中間插入的潮霉素抗基因表達(dá)框。
　　 4.

4、cps/ks基因取代載體和紫杉烯合酶基因表達(dá)載體共轉(zhuǎn)化赤霉菌的研究
　　 將cps/ks基因取代載體pMD3036FM(e)HmB與pITS1共轉(zhuǎn)化赤霉菌N.920菌株，獲得了近百株抗性轉(zhuǎn)化子，對(duì)其中的部分轉(zhuǎn)化子進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定與篩選，獲得10余株潮霉素抗性基因整合型轉(zhuǎn)化子，其中1株(CHITS9)還攜帶紫杉烯合酶基因，但上述轉(zhuǎn)化子中，尚未篩選到cps/ks基因取代菌株，還有一些轉(zhuǎn)化子有待繼續(xù)鑒定；含有紫杉烯合酶基因的轉(zhuǎn)化子的次