南方紅豆杉產(chǎn)紫杉烷類(lèi)化合物內(nèi)生真菌的分離與遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、紫杉醇是一種二萜類(lèi)的生物堿，最初從太平洋短葉紅豆杉(Taxus brevifoliaNutt.)的樹(shù)皮中分離到，研究發(fā)現(xiàn)紫杉醇對(duì)包括卵巢癌在內(nèi)的多種癌癥具有良好療效。由于紫杉醇在樹(shù)皮中含量很低并且提取過(guò)程繁瑣，因而價(jià)格昂貴，很大程度上限制了紫杉醇的應(yīng)用。隨著紫杉醇的需求日益增長(zhǎng)，紫杉醇的供求矛盾也日益突出，這促使人們嘗試各種途徑擴(kuò)大紫杉醇的來(lái)源。自從1993年Stierle首次從紅豆杉樹(shù)皮中分離得到一株產(chǎn)紫杉醇真菌Taxomyces a

2、ndreanae以來(lái)，越來(lái)越多的產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌被分離出來(lái)，這為人們通過(guò)微生物發(fā)酵大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)紫杉醇提供了可能。
　　本研究從安徽石臺(tái)縣仙寓山一株百年野生南方紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)樹(shù)皮中，分離得到一株產(chǎn)紫杉醇重要前體物質(zhì)巴卡亭Ⅲ的內(nèi)生真菌。經(jīng)過(guò)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，將該真菌鑒定為擬盤(pán)多毛孢屬(Pestalotiopsis sp.)，并命名為T(mén)L9。通過(guò)單因素和4因素3水平正交實(shí)驗(yàn)確定了該

3、真菌的最佳碳源和氮源，進(jìn)而優(yōu)化真菌的發(fā)酵培養(yǎng)基。
　　以分離得到的真菌為材料，根據(jù)南方紅豆杉紫杉醇合成途徑關(guān)鍵酶10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰轉(zhuǎn)移酶(DBAT)的基因dbat的序列(AY365031.2)設(shè)計(jì)引物，同源克隆得到一段長(zhǎng)為706 bp的片斷，經(jīng)BLAST序列比對(duì)確認(rèn)為真菌dbat基因的核心片斷，然后通過(guò)反向PCR技術(shù)，擴(kuò)增得到一段長(zhǎng)為753 bp的片斷，經(jīng)過(guò)序列分析后與核心片斷進(jìn)行拼接，得到一段長(zhǎng)為1281 bp的

4、片斷。序列比對(duì)顯示該片段與紅豆杉植物dbat基因相似度達(dá)到97％，因此確認(rèn)為真菌dbat基因的核心片斷。
　　以真菌TL9為材料，測(cè)定真菌的生長(zhǎng)曲線(xiàn)，確定處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中期（約4天左右）為制備原生質(zhì)體的最佳時(shí)間。通過(guò)選擇合適的酶，調(diào)整酶的作用溫度和作用時(shí)間，優(yōu)化原生質(zhì)體的制備流程。以潮霉素B為篩選劑，確定潮霉素B濃度150 ug/L適合作為真菌TL9遺傳轉(zhuǎn)化的篩選壓濃度。以pCAMBIA1304和真菌表達(dá)載體pAN7-1為材料，構(gòu)

5、建了以潮霉素抗性基因?yàn)楹Y選標(biāo)記適合用于根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雙元載體，并轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌。以真菌TL9的原生質(zhì)體為受體，考察了培養(yǎng)支持物、根癌農(nóng)桿菌菌株、AS添加方式、AS濃度、原生質(zhì)體濃度、根癌農(nóng)桿菌的濃度、共培養(yǎng)條件等多方面因素，確定了適合該真菌的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化條件，從而建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的該真菌原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化平臺(tái)，最高轉(zhuǎn)化率約為55個(gè)轉(zhuǎn)化子/107個(gè)原生質(zhì)體，并且潮霉素抗性穩(wěn)定遺傳。根據(jù)南方紅豆杉(Taxuschinensis vat mai

6、rei)紫杉醇合成途徑紫杉二烯合酶(Taxadiene synthase，TS)，10-去乙酰巴卡亭Ⅲ-10β-乙酰轉(zhuǎn)移酶(10-deacetyl-baccatinⅢ-10β-O-acetyltransferase，DBAT)，3-氨基-3-苯基丙酰轉(zhuǎn)移酶(3-amino-3-phenylpropanoyltransferase，BAPT)三個(gè)關(guān)鍵酶的基因序列設(shè)計(jì)引物，構(gòu)建了紫杉醇合成途徑關(guān)鍵酶基因真菌表達(dá)載體pTS，pDBAT，pBA