南方紅豆杉內(nèi)生真菌的分離及紫杉烷類產(chǎn)生菌的篩選及其特性研究.pdf

1、以紫杉醇為代表的紫杉烷二萜是一類新型有效的天然抗腫瘤藥物,藥源匱乏,價(jià)格昂貴.以真菌取代紅豆杉植物,通過微生物發(fā)酵工程途徑獲得紫杉醇,是擴(kuò)大藥源的一個(gè)具有潛力的方向.本篇論文,首次系統(tǒng)地針對南中國所特有的紅豆杉屬變種植物——南方紅豆杉,開展內(nèi)生真菌的篩選發(fā)掘和產(chǎn)紫杉醇的研究.目的在于利用國內(nèi)豐富的生物種質(zhì)資源探尋紫杉醇的新藥源途徑,獲得有效分泌紫杉烷物質(zhì)的目標(biāo)新菌株,同時(shí)利用真菌在培養(yǎng)、調(diào)控和改造方面的便利性,為研究解決困擾紫杉醇規(guī)模產(chǎn)

2、出的一些關(guān)鍵問題并最終通過微生物工程途徑生產(chǎn)該藥物奠定基礎(chǔ).以20~100a以上生樹齡、胸徑0.65~1.95m的南方紅豆杉為分離材料,截取樹皮、形成層、樹葉、葉芽、種子胚、木質(zhì)部等不同部位組織,以絲狀真菌為分離目標(biāo),經(jīng)過先后6個(gè)批次的分離純化,獲得289株單一菌種,實(shí)驗(yàn)菌株109個(gè)(其中絲狀真菌105個(gè),放線菌4個(gè)).從外皮、韌皮部和木質(zhì)部得到的菌種數(shù)比例約為3:2:1.首批選取20個(gè)菌株,經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)和靜止培養(yǎng),再用二氯甲烷萃取抽提

3、培養(yǎng)液,獲得20個(gè)萃取產(chǎn)物.以絲狀真菌分類鑒定法研究了目標(biāo)菌株的形態(tài)結(jié)構(gòu),鑒定結(jié)果,1611-E和2212-C分別為無色叢梗孢的輪柄梳霉型和頭孢霉型,主要行無性分生孢子式繁殖;2222-D為無孢菌群,具有特化的珊瑚狀束式須根,以菌絲機(jī)制生長繁殖.這些有同一化產(chǎn)物但無親緣關(guān)系的真菌,表明紅豆杉內(nèi)生真菌的存在并同宿主一樣具有產(chǎn)紫杉烷的能力,可能是一種普遍現(xiàn)象.同步研究了1611-C、2212-C、2222-B、2222-D、2611、312

4、1-A和3221-C等7株真菌的胞外粗提產(chǎn)物對肝癌細(xì)胞BEL-7402的體外細(xì)胞毒效應(yīng),并根據(jù)MTT比色分析法及倒置顯微鏡下的細(xì)胞形態(tài)以評價(jià)不同濃度藥物對癌細(xì)胞株所起的細(xì)胞毒作用效果.通過基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加調(diào)節(jié)因子,研究了2222-D菌株的合成代謝生理.結(jié)果表明,在培養(yǎng)中添加前體物質(zhì)(乙酸鈉、苯丙氨酸及其組合)、同代謝途徑產(chǎn)物(棉酚)、生物調(diào)節(jié)因子(菜籽餅、紅豆杉枝葉、內(nèi)生真菌、外源真菌)和異構(gòu)低聚糖等多類型物質(zhì),除異構(gòu)低聚糖的表現(xiàn)不太明