南方紅豆杉內生真菌多樣性、次生代謝產(chǎn)物及其與宿主的相關性研究.pdf

1、本課題以我國珍稀保護藥用植物南方紅豆杉內生真菌為研究對象，對其生物多樣性及代謝產(chǎn)物和其與宿主的相關性進行系統(tǒng)地研究，以期為開發(fā)新的天然藥物資源和提高藥材品質提供新的思路。
　　 與已報道的同屬植物相比，南方紅豆杉具有更加豐富的內生真菌種類。從3個產(chǎn)地(江西井岡山、浙江景寧、重慶縉云山)南方紅豆杉3個部位(葉片、枝條、樹皮中)共分離得到2442株內生真菌，根據(jù)菌株群落的培養(yǎng)特征及5.8S和ITS區(qū)片段序列相似性比較和系統(tǒng)發(fā)育分析，

2、共鑒定為145個分類單元(分子鑒定143個分類單元，2個未能進行分子鑒定的形態(tài)型)，歸屬到真菌界3個門6個綱20個目66個屬，其中125個分類單元(占總數(shù)的86.2％)屬于子囊菌門，14個(占9.8%)屬于擔子菌門，5個(3.4%)屬于接合菌門，1個(0.7%)未確定分類地位。南方紅豆杉內生真菌生物多樣性及豐度受組織類型影響顯著，枝條、樹皮中內生真菌多樣性及豐度為葉片的1.2-3倍。
　　 地理位置、組織類型對南方紅豆杉內生真菌

3、組成及分布具有顯著的影響，優(yōu)勢類群(目、屬、種水平上)存在產(chǎn)地間、部位間明顯差異。鑒定的145個分類單元中，僅10個分類單元為3個地點共有，20個分類單元為2個地點共有，其他分類單元只在1個地點出現(xiàn)。Hypoxylon、Pezicula、Pestalotiopsis為不同產(chǎn)地特有的優(yōu)勢屬；最優(yōu)勢目Magnaporthales、Botryosphaeriales、Glomerellales、Diaporthales、Xylariales、

4、Helotiales、Hypocreales，最優(yōu)勢屬Phyllosticta/Guignardia、Colletotrichum/Glomerella、Phomopsis、Hypocrea/Trichoderma、Pezicula的分布具有顯著的組織特異性。大多數(shù)優(yōu)勢種都表現(xiàn)出明顯的地理特異性或組織特異性，許多分離頻率低的菌還表現(xiàn)出地理專一性或組織專一性。由于產(chǎn)地和部位的作用，更多種類的內生真菌從南方紅豆杉中獲得。南方紅豆杉豐富多樣的

5、內生真菌種類是極其重要的資源寶庫，為內生真菌后續(xù)研究工作提供了重要素材。
　　 利用高效液相色譜法測定有效成分(Taxol、10-DABⅢ)的含量，并結合南方紅豆杉相關化學成分的HPLC-TOF/MS數(shù)據(jù)分析，比較3個產(chǎn)地南方紅豆杉3個部位化學成分包括有效成分的差異。結果表明南方紅豆杉Taxol與10-DABⅢ含量存在部位間、產(chǎn)地間顯著差異。3個產(chǎn)地的南方紅豆杉的Taxol含量均以樹皮部位明顯高于枝條、葉片部分，且以江西產(chǎn)地樹皮

6、含量最高；3個產(chǎn)地的南方紅豆杉10-DABⅢ含量則均以葉片明顯高于枝條、樹皮部分，且以江西產(chǎn)地葉片中含量最高。
　　 從化學成分質譜數(shù)據(jù)初步鑒別結果來看，南方紅豆杉植物中的化學成分極為復雜，包含紫杉烷類化合物，部分松香烷類、木脂素類等化合物。南方紅豆杉葉片、枝條、樹皮3個部位化學成分的差異顯著，這與內生真菌菌群部位間的差異結果相符。通過對飛行時間質譜數(shù)據(jù)的PLSDA分析篩選出18個在部位間分布有明顯差異的化合物，比對確立的南方紅

7、豆杉化學成分數(shù)據(jù)庫初步鑒別出11個化合物，8個紫杉烷二萜類(P2、P5-P7、N1、N2、N7-N9)、1個松香烷二萜類(N6)、和2個木脂素類(N3、N5)。
　　 進一步考察南方紅豆杉化學成分包括有效成分與內生真菌之間的關系，發(fā)現(xiàn)18個部位間差異化合物的量與一些具有組織特異性的內生真菌有關，它們之間存在正相關關系和負相關關系，表明內生真菌部位間的差異與宿主植物部位間成分差異相關。有效成分(Taxol與10-DABⅢ)含量與一

8、些有組織特異性的優(yōu)勢類群的分布存在顯著的相關性。與Taxol含量顯著相關的有：在目水平上，Helotiales、Hypocreales、Xylariales目；在屬水平上，Hypocrea，Pezicula屬；在種水平上，Hypocrealixii。與10-DABⅢ的含量顯著相關的有：在目水平上，Botryosphaeriales、Magnaporthales目；在屬水平上，F(xiàn)usarium/Gibberella、Phyllostict

9、a/Guignardia屬；在種水平上，Colletotrichumg loeosporioides，Glomerella lindemuthiana，Magnaporthales sp.2、Xylarialessp.1。Taxol或10-DABⅢ的含量和與其相關的不同內生真菌類群的相對頻率之間的關系均最符合立方模型(CubicModel)。研究闡明內生真菌對藥材品質(有效成分的含量)的影響，對提高藥材品質、篩選優(yōu)質藥材具有重要的理論價

10、值和現(xiàn)實意義。
　　 通過稻瘟霉模型篩選和與宿主化學成分比較分析相結合的方法，對鑒定的145個內生真菌分類單元發(fā)酵提取物進行篩選，以Perenniporia tephropora(Z41)的抗稻瘟霉活性最好，并且與宿主共有的分子特征離子數(shù)目最多，因此對該菌發(fā)酵物乙酸乙酯提取部位進行分離，利用波譜方法共鑒定了5個化合物，1個新型的倍半萜類化合物PerenniporinA和4個已知化合物2-5依次為ergosterol、rel-(+

11、)-(2aR，5R，5aR，8S，8aS，8bR)-decahydro-2，2，5，8-tetramethyl-2H-naphtho[1，8-bc]furan-5-ol、albicanol、para-methoxybenzoic acid，這些化合物都是首次從Perenniporia屬真菌分離得到。Perenniporia tephropora發(fā)酵物的乙酸乙酯提取物(EPT)及5個化合物對HeLa細胞，SMMC-7721和PANC-1細