金銀花內(nèi)生真菌與其次生代謝產(chǎn)物相關(guān)性研究.pdf

1、　　目的：研究金銀花內(nèi)生真菌與其次生代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性,初步探討不同產(chǎn)區(qū)金銀花內(nèi)生真菌與其地道性之間的相關(guān)性,利用內(nèi)生真菌評價金銀花的地道性；通過對產(chǎn)綠原酸菌株 XM20 培養(yǎng)及發(fā)酵條件的優(yōu)化和誘變育種,篩選出穩(wěn)定高產(chǎn)突變菌株,并對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定,確定其分類學(xué)地位。
　　方法：應(yīng)用組織分離法對不同產(chǎn)區(qū)、金銀花不同器官內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和鑒定；采用 SPSS 聚類分析法對不同產(chǎn)區(qū)金銀花內(nèi)生真菌及其道地性進(jìn)行評價；采用單因素

2、和四因素三水平正交試驗對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,通過紫外線誘變、NaNO2 誘變及復(fù)合誘變等方法篩選出高產(chǎn)突變菌株,結(jié)合高效液相色譜法對綠原酸含量進(jìn)行測定。利用分子生物學(xué)方法對一株產(chǎn)綠原酸菌株 XM20 進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：
　　1 不同產(chǎn)區(qū)金銀花內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)研究
　　對不同產(chǎn)區(qū)金銀花種群結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,初步鑒定為 5 目、5 科、10屬,金銀花內(nèi)生真菌以無孢菌科、曲霉屬及鏈格孢屬為優(yōu)勢種群,河南新密的金銀花

3、內(nèi)生真菌種類最為豐富,在屬的水平上和個體分離數(shù)量上均最多；其次依次為山東平邑,河南封丘和河北巨鹿,充分說明了金銀花內(nèi)生真菌在地理分布上具有一定的地域性和專一性。通過相關(guān)性分析,鏈格 孢屬 與 金銀 花有 效成 分 綠原 酸和 木犀 草 苷之 間均 呈顯 著 正相 關(guān)( p<0.05),說明金銀花內(nèi)生真菌中鏈格孢屬的存在與否可以影響促進(jìn)的金銀花中次生代謝產(chǎn)物的形成。
　　2 金銀花內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物研究
　　通過對不同產(chǎn)

4、地金銀花內(nèi)生真菌的分離和純化,利用薄層層析法、紫外分光光度法及高效液相色譜法,發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地金銀花中內(nèi)生真菌均存在可以產(chǎn)生綠原酸的菌株,但綠原酸含量有所差別,而以河南新密和封丘金銀花中分離出的菌株產(chǎn)綠原酸含量較高。通過抑菌試驗,篩選出具有高抑菌活性的菌株 XM20,能夠?qū)θN供試細(xì)菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌)表現(xiàn)出較好的廣譜抑菌活性。
　　3 金銀花內(nèi)生真菌的誘變及發(fā)酵試驗
　　采用紫外線誘變、NaNO2

5、誘變以及二者的復(fù)合誘變,對具有高抑菌活性的菌株 XM20 進(jìn)行誘變育種,得到高產(chǎn)突變菌株 X-UH-8,對菌株X-UH-8 進(jìn)行十次繼代試驗,結(jié)果表明菌株 X-UH-8 具有良好的穩(wěn)定性,提示此菌株可以作為后期發(fā)酵試驗的原始菌株,此外,通過對菌株 X-UH-8進(jìn)行培養(yǎng)條件的優(yōu)化,以菌絲干重和綠原酸含量為指標(biāo),篩選出了最佳固體培養(yǎng)基為馬丁氏培養(yǎng)基,最佳液體培養(yǎng)基為馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基,單因素比較試驗確定菌株 X-UH-8 發(fā)酵的最佳碳源為蔗糖

6、、氮源為蛋白胨,培養(yǎng)溫度為 30℃, pH 值為 7.0。通過正交試驗優(yōu)化菌株 X-UH-8 發(fā)酵條件,選擇出的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基為含蔗糖 2.5%,蛋白胨 0.3%,pH 值為 7.0,溫度為 26℃,在此條件下,菌絲干重和綠原酸相對含量達(dá)到最大值,分別為 4.36g/L 和 0.4176mg/L.
　　4 金銀花內(nèi)生真菌的分子生物學(xué)鑒定
　　通過對供試菌株 X-UH-8 的 ITS 序列與 NCBI 數(shù)據(jù)庫中有關(guān)序列