牡丹內(nèi)生真菌與其丹皮道地性成因相關(guān)性研究.pdf

1、道地藥材是指經(jīng)過中醫(yī)臨床長期應(yīng)用優(yōu)選出來的，在特定地域，通過特定生產(chǎn)過程所產(chǎn)的，較在其他地區(qū)所產(chǎn)的同種藥材品質(zhì)佳、療效好，具有較高知名度的藥材。內(nèi)生真菌是指整個生活史或者生活史的一部分存在于植物組織內(nèi)部，而未對植物健康造成明顯傷害的一類真菌。內(nèi)生真菌普遍存在于健康植物組織中，種類繁多、分布廣泛，且具有合成大量藥用活性物質(zhì)的巨大潛力。為了研究牡丹內(nèi)生真菌與其丹皮道地性是否存在相關(guān)性，本試驗選取道地丹皮的安徽鳳丹牡丹植株，非道地丹皮的洛陽鳳

2、丹和著名觀賞牡丹品種洛陽紅植株種群為研究對象，首先對安徽鳳丹丹皮的道地性進(jìn)行驗證，然后從三種牡丹植株中分離、鑒定內(nèi)生真菌，并對內(nèi)生真菌種群做多樣性分析，從中篩選出能夠產(chǎn)生丹皮酚的內(nèi)生真菌，并對各個牡丹品種內(nèi)生真菌的PKS，NRPS基因進(jìn)行篩選，試驗結(jié)果如下：
　　(1)采用高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用方法（HPLC-MS）對安徽鳳丹，洛陽鳳丹，洛陽紅牡丹三種牡丹的丹皮中的丹皮酚進(jìn)行鑒定，同時采用色譜法對其丹皮酚含量進(jìn)行測定。質(zhì)譜結(jié)果顯示在

3、保留時間31.87 min左右時，三種牡丹丹皮提取液與丹皮酚標(biāo)準(zhǔn)品出峰時間一致，離子碎片信息一致；在選定的色譜條件下，丹皮酚的線性方程為Y=-388882+3.12948×106X，且在0.1μg/mL~20μg/mL濃度下具有良好的線性關(guān)系，丹皮酚含量測定結(jié)果顯示安徽鳳丹丹皮中丹皮酚的含量為24.51?0.83 mg/g，洛陽紅牡丹丹皮中丹皮酚含量為14.29?0.76 mg/g，洛陽鳳丹丹皮中丹皮酚含量為8.76?0.46 mg/g

4、，t檢驗法對三組之間的差異性檢驗結(jié)果顯示安徽鳳丹丹皮中丹皮酚的含量顯著大于洛陽紅牡丹丹皮和洛陽鳳丹丹皮中丹皮酚的含量。
　　(2)試驗采用表面消毒法對安徽鳳丹，洛陽鳳丹，洛陽紅三種牡丹的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，從3種牡丹植株中分別分離出了60、98、206株內(nèi)生真菌。用分子生物學(xué)方法對牡丹內(nèi)生真菌進(jìn)行分類鑒定，結(jié)果顯示三種牡丹的內(nèi)生真菌分屬于17、9、10個不同的種屬，優(yōu)勢菌種屬分別是Phomopsis（擬莖點霉屬）、Fusarium（

5、鐮孢菌屬）、Alternaria（鏈格孢屬）。安徽鳳丹內(nèi)生真菌在數(shù)量和種類上與其余兩種牡丹的內(nèi)生真菌差異較大，且香農(nóng)多樣性指數(shù)、辛普森多樣性指數(shù)以及均勻度均優(yōu)于其他兩種牡丹內(nèi)生真菌，在相似性方面，三種牡丹的內(nèi)生真菌兩兩之間相似性并沒有顯著差異。
　　(3)試驗采用甲醇對內(nèi)生真菌的新鮮菌絲進(jìn)行索氏提取，提取液經(jīng)薄層色譜檢測，篩選產(chǎn)丹皮酚的牡丹內(nèi)生真菌。對初篩陽性結(jié)果用氣質(zhì)聯(lián)用儀進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。結(jié)果從157株內(nèi)生真菌中共篩選出16株產(chǎn)

6、丹皮酚的牡丹內(nèi)生真菌，分屬于Alternaria（鏈格孢屬），F(xiàn)usarium（鐮孢菌屬），Phoma（莖點霉屬），Botryosphaeria（葡萄座腔菌屬），Paraconiothyrium（擬盾殼霉屬），Chaetomium（毛殼菌屬）， Talaromyces（踝節(jié)菌屬），Phyllosticta（葉點霉屬），Schizophyllum（裂褶菌屬）共9個種屬，其中Fusarium（鐮孢菌屬）7株，Paraconiothyrium

7、2（擬盾殼霉屬）株，其余種屬各1株，F(xiàn)usarium（鐮孢菌屬）是產(chǎn)丹皮酚的優(yōu)勢菌種。從安徽鳳丹中分離出的內(nèi)生真菌占4株，從洛陽鳳丹中分離出的內(nèi)生真菌占12株，洛陽紅牡丹內(nèi)生真菌中沒有篩選到能夠產(chǎn)生丹皮酚的內(nèi)生真菌。
　　(4)試驗從三種牡丹的內(nèi)生真菌群體中篩選出了含有 PKS和 NRPS基因片段的內(nèi)生真菌，對所測得的序列進(jìn)行了BLASTX比對，并統(tǒng)計了PKS和NRPS基因篩選陽性率。結(jié)果顯示安徽鳳丹中分離的內(nèi)生真菌PKS陽性率4

8、8.15％大于洛陽鳳丹（41.07%）和洛陽紅（44.59%），NRPS陽性率11.11%大于洛陽鳳丹（7.14%）和洛陽紅（1.35%）。
　　結(jié)論：內(nèi)生真菌廣泛分布于牡丹植株中，不同品種、不同地區(qū)的牡丹內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)和多樣性方面差異明顯，安徽鳳丹內(nèi)生真菌在多樣性方面高于其他品種；牡丹內(nèi)生真菌具有合成丹皮藥用活性成分?丹皮酚的能力，從分離的情況來看，產(chǎn)丹皮酚的內(nèi)生真菌集中分布于鳳丹品種；不同品種的牡丹內(nèi)生真菌合成次生代謝物的潛