地黃內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)性研究.pdf

1、地黃(Rehmannia glutinosa Libosch.)屬于玄參科（Scrophulariaceae）多年生草本植物，是傳統(tǒng)的道地中藥材，一直被視為中藥材的上品，是我國著名的“四大懷藥”之一。地黃含有許多對(duì)人體有益的活性成分，其中研究和應(yīng)用較多的是環(huán)烯醚萜苷類物質(zhì)——梓醇。一直以來，微生物都是人們獲取活性物質(zhì)的豐富資源，許多具有良好治療效果的抗生素都是從微生物中得到的。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，植物內(nèi)生真菌廣泛存在于許多植物中，種類繁多，

2、且某些植物內(nèi)生真菌具有能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似活性成分的特性，因此，藥用植物內(nèi)生真菌在農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥業(yè)中具有很大的應(yīng)用潛力。
　　目的：探討地黃內(nèi)生真菌及其次生代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，初步了解其內(nèi)生真菌的多樣性。嘗試從內(nèi)生真菌中篩選出產(chǎn)地黃活性成分——梓醇的菌株，并對(duì)篩選出的活性菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化及高產(chǎn)誘變，以期獲得穩(wěn)定的高產(chǎn)突變菌株。
　　方法：本課題以地黃不同營養(yǎng)器官（塊根、葉片）及塊根的不同部位（表皮、韌皮部、木質(zhì)部）為

3、試驗(yàn)材料，采用組織塊法對(duì)其進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離、純化及鑒定，研究其內(nèi)生真菌的種類、組成及其在不同器官或部位中的分布特點(diǎn)；將分離出的內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，采用 TLC法、HPLC法等方法來篩選產(chǎn)梓醇的內(nèi)生真菌，并研究其生物學(xué)特性；采用單因素試驗(yàn)和L9（34）正交試驗(yàn)對(duì)所篩選出的高產(chǎn)活性菌株進(jìn)行發(fā)酵工藝的優(yōu)化；采用單因素誘變和復(fù)合誘變的方法篩選出高產(chǎn)突變菌株，并結(jié)合 HPLC法對(duì)梓醇產(chǎn)量進(jìn)行測定；利用分子生物學(xué)對(duì)一株產(chǎn)梓醇的高產(chǎn)菌株CB37進(jìn)

4、行鑒定。
　　結(jié)果：
　　1、地黃內(nèi)生真菌種群結(jié)構(gòu)的研究
　　從地黃不同營養(yǎng)器官或部位中共分離得到內(nèi)生真菌362株，其中有282株產(chǎn)孢子，經(jīng)鑒定分布在5目、6科、11個(gè)屬，其中鐮孢菌屬真菌共97株，占所有已鑒定出菌株的34.4％，為地黃內(nèi)生真菌的優(yōu)勢菌屬。
　　2、地黃內(nèi)生真菌次生代謝產(chǎn)物——梓醇的研究
　　通過對(duì)地黃不同營養(yǎng)器官和塊根不同部位的內(nèi)生真菌進(jìn)行分離和純化，利用 TLC法和HPLC法檢測發(fā)現(xiàn)，不

5、同器官和部位中均不同程度的存在可以產(chǎn)梓醇的菌株，但其含量有所差別。共篩選出7株具有產(chǎn)梓醇能力的菌株，其中，產(chǎn)梓醇含量最高的菌株編號(hào)為 CB37，它是分離自表皮的內(nèi)生真菌，其梓醇產(chǎn)量達(dá)到2.31g/L（地黃植株中塊根表皮部位的梓醇含量為2.92%）。
　　3、產(chǎn)梓醇內(nèi)生真菌CB37最優(yōu)發(fā)酵工藝的研究
　　通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)相結(jié)合的方法，篩選出菌株 CB37的最優(yōu)發(fā)酵工藝為：以 PDB培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別加入葡萄糖10.0g

6、/L、酵母膏15.0g/L，培養(yǎng)基起始 pH7.0，以2%的接種量接種于50mL培養(yǎng)基中，28℃恒溫震搖（120r·min-1）培養(yǎng)6d。與初始培養(yǎng)條件相比，菌絲生物量達(dá)到2.73 g/L，增幅為7.77%，梓醇產(chǎn)量達(dá)到2.38g/L，增幅為2.89%。
　　4、產(chǎn)梓醇內(nèi)生真菌CB37高產(chǎn)誘變的研究
　　通過采用紫外誘變、亞硝酸誘變的單因素誘變和二者復(fù)合誘變相結(jié)合的方法，對(duì)具有產(chǎn)梓醇能力的菌株 CB37進(jìn)行誘變育種，選育出梓

7、醇的高產(chǎn)突變菌株B-UH-5，其產(chǎn)量可以達(dá)到2.71g/L，較出發(fā)菌株 CB37增產(chǎn)17.32%，將 B-UH-5進(jìn)行十次傳代培養(yǎng)，表明其具有一定的遺傳穩(wěn)定性。
　　5、產(chǎn)梓醇內(nèi)生真菌CB37的分子生物學(xué)鑒定
　　通過將供試菌株 CB37的ITS序列與 NCBI數(shù)據(jù)庫中相似性高的序列進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定方法，將菌株 CB37鑒定為鐮孢菌屬尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）。
　　結(jié)論：通過