糙皮側(cè)耳栽培種EST--SSR標(biāo)記應(yīng)用及初級(jí)核心種質(zhì)庫(kù)的構(gòu)建.pdf

1、DevelopmentofESTSSRMarkersinConstructionofPrimaryCoreCollectionThe“submittedt01laeslsSUmlttetodaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeof—MasterofScienceZhangXue—mei(CollegeofLifeSciences)Supervi

2、sor：GongZhiyuanSongAirongQingdaoChinaJune，2012摘要糙皮側(cè)耳(Pleurotusostreatus)是我國(guó)食用菌的主要栽培品種之一，但因其菌株名稱混亂，同名異物、同物異名現(xiàn)象嚴(yán)重，一定程度上阻礙了食用茵產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，因此需要一種快速、簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的鑒別分類方法。本文搜集整理了國(guó)內(nèi)外糙皮側(cè)耳栽培種的種質(zhì)資源庫(kù)，結(jié)合農(nóng)藝學(xué)性狀和ESTSSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了糙皮側(cè)耳栽培種初級(jí)核心種質(zhì)庫(kù)j并初步進(jìn)行了核

3、心種質(zhì)庫(kù)的DNA指紋圖譜分析。從國(guó)內(nèi)外糙皮側(cè)耳栽培的主產(chǎn)區(qū)搜集整理栽培種共299株，通過品種栽培試驗(yàn)初步排除同種異名，結(jié)合來源地與栽培學(xué)農(nóng)藝性狀進(jìn)行分區(qū)，根據(jù)菌絲生物學(xué)特性及子實(shí)體長(zhǎng)勢(shì)從中隨機(jī)取樣選出185株用于構(gòu)建初級(jí)核心種質(zhì)庫(kù)。通過搜索、剪切和重組NCBI等數(shù)據(jù)庫(kù)公布的側(cè)耳、靈芝、香菇的EST序列，用Primer50軟件開發(fā)出9條側(cè)耳ESTSSR引物，58條靈芝ESTSSR引物，35條香菇ESTSSR引物。通過優(yōu)化試驗(yàn)確定PCR反應(yīng)

4、體系為(25gL)：10x緩沖液25此，25mmol的dNTPs20gL，25UgL’1Taq酶025灶L，10gML。的正反向引物各10皿，模板50～100ng；PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4。C預(yù)變性5min；94℃變性30s；50～65。C復(fù)性45s；72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；產(chǎn)物用2％的瓊脂糖凝膠(含溴乙錠05gg／mL)電泳檢測(cè)。對(duì)靈芝引物和香菇引物在糙皮側(cè)耳上進(jìn)行了通用性研究：隨機(jī)選取5株糙皮側(cè)耳菌株對(duì)1

5、02對(duì)引物進(jìn)行初篩，篩選出16對(duì)能擴(kuò)增出條帶的引物，占27％；6對(duì)香菇引物能擴(kuò)增出條帶，占l7％；進(jìn)一步在16個(gè)糙皮側(cè)耳菌株上對(duì)靈芝的16對(duì)引物和香菇的6對(duì)引物進(jìn)行復(fù)篩，其中4對(duì)靈芝引物和2對(duì)香菇引物能擴(kuò)增出穩(wěn)定、清晰且多態(tài)性好的帶型。重復(fù)試驗(yàn)選出4條多態(tài)性好、條帶清晰的引物，對(duì)選取的185株糙皮側(cè)耳栽培種進(jìn)行擴(kuò)增分析：共擴(kuò)增得到59條帶，每個(gè)引物擴(kuò)增條帶數(shù)為12—19條，擴(kuò)增片段在100～1100bp之間；根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果采用符合系數(shù)計(jì)算

6、個(gè)體間的相似距離，用不加權(quán)類平均法(UPGMA)進(jìn)行系統(tǒng)聚類；根據(jù)計(jì)算各位點(diǎn)等位基因的頻率，確定各位點(diǎn)最低和最高頻率的等位基因，優(yōu)先選取具有這些稀有等位基因的個(gè)體作為核心材料；對(duì)于剩余的材料采用多次聚類隨機(jī)取樣法抽取核心種質(zhì)，最終構(gòu)建了一個(gè)含47株糙皮側(cè)耳栽培種的初級(jí)核心種質(zhì)庫(kù)Pcore47。經(jīng)分析得到：Pcore47占原群體樣品數(shù)25％，占資源庫(kù)的13％；有效等位基因數(shù)和多態(tài)性位點(diǎn)占有率與原群體一致，多樣性指數(shù)均值比原群體高01274