組織工程化SIS生物膜促進(jìn)牽引成骨的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、下頜骨缺損是口腔頜面部最常見的一種硬組織缺損，傳統(tǒng)的修復(fù)方法有骨代用品植入、異體骨移植、自體骨移植等，但以上方法均存在自身難以克服的缺點(diǎn)。牽引成骨是上個(gè)世紀(jì)發(fā)展起來的一種矯形外科技術(shù)，自1992年由McCarthy等引入到口腔頜面外科領(lǐng)域后，由于口腔頜面部骨骼解剖結(jié)構(gòu)及功能的特殊性，該技術(shù)在顱頜面骨畸形的矯治以及頜骨缺損的修復(fù)中得到很大的發(fā)展和飛躍，目前的應(yīng)用也已經(jīng)比較成熟廣泛。但它存在治療周期長、成骨質(zhì)量不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，特別隨著功能性外

2、科以及種植外科的興起和發(fā)展，對(duì)牽引成骨的速度以及成骨質(zhì)量等方面提出了更高的要求，在大型頜骨缺損的修復(fù)(如下頜骨角一角缺損)以及復(fù)雜的牽引成骨(如DID)中，牽引成骨的諸多缺點(diǎn)更加彰顯。 組織工程技術(shù)是結(jié)合組織學(xué)與工程學(xué)的原理與方法，在體外構(gòu)建具有生命活力的組織和器官的一種方法。將組織工程技術(shù)的有關(guān)原理與方法應(yīng)用于牽引成骨過程中，有望縮短牽引成骨的治療時(shí)間并提高牽引區(qū)的成骨質(zhì)量。 【研究目的】 1．對(duì)小腸粘膜下層(

3、S I S)的理化性能及生物相容性進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)其作為組織工程支架材料的可行性。 2．將骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)與小腸粘膜下層(SIS)進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，檢測細(xì)胞的形態(tài)與功能，在體外構(gòu)建組織工程化SIS生物膜。 3．建立山羊管狀骨橫向牽引同期種植的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，并對(duì)相關(guān)的成骨指標(biāo)進(jìn)行檢測，為后續(xù)的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。 4．利用組織工程化SIS生物膜修補(bǔ)DID手術(shù)過程中損傷的缺損骨膜，通過對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究，檢測牽引區(qū)的

4、成骨情況，對(duì)組織工程化SIS生物膜的成骨促進(jìn)作用進(jìn)行評(píng)價(jià)。 【方法與結(jié)果】 1．小腸粘膜下層(SIS)的理化性能及生物相容性研究方法：參照國際標(biāo)準(zhǔn)ISO10993—1制定的醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)的相關(guān)方法和標(biāo)準(zhǔn)，通過PH值測定、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、熱原試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、致敏試驗(yàn)、肌肉刺激試驗(yàn)等體內(nèi)外生物學(xué)實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法評(píng)價(jià)SIS作為組織工程支架材料的生物相容性及免疫原性。結(jié)果：實(shí)驗(yàn)證明小腸粘膜下層(SIS)浸提液的PH值接近中性，

5、細(xì)胞相容性良好，不溶血，無致熱、致敏反應(yīng)，肌肉刺激試驗(yàn)的組織學(xué)檢查顯示SIS周圍無明顯炎癥反應(yīng)及排斥反應(yīng)，僅見少量淋巴細(xì)胞及多核巨細(xì)胞，材料出現(xiàn)部分降解并見大量纖維結(jié)締組織生長。 2．組織工程化SIS生物膜的構(gòu)建方法：將山羊BMSCs體外行成骨誘導(dǎo)至第3代，接種到預(yù)濕的SIS生物膜上進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)，以相同條件下單純培養(yǎng)的BMSCs作為對(duì)照。通過相差顯微鏡、掃描電子顯微鏡以及改進(jìn)的組織塊HE染色等方法觀察細(xì)胞在材料中的生長情況；四唑

6、鹽MTT法檢測BMSCs在材料上的增殖活性；通過堿性磷酸酶(ALP)活性測定及裸鼠皮下異位成骨實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)細(xì)胞的成骨性能。結(jié)果：掃描電鏡及組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞材料復(fù)合后，BMSCs在小腸粘膜下層(SIS)上能夠良好地粘附和增殖；MTT及ALP測定結(jié)果顯示，BMSCs細(xì)胞活性及成骨性能未受SIS的影響，與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。體內(nèi)異位成骨實(shí)驗(yàn)表明，BMSCs／SIS復(fù)合物植入體內(nèi)后成骨良好，以軟骨內(nèi)成骨方式為主。

7、 3．山羊管狀骨橫向牽引同期種植實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立方法：以成年山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物(共3只，行單側(cè)脛骨垂直牽引)，以我們課題組自行開發(fā)設(shè)計(jì)的第四代同期種植牽引器為牽引裝置，依照臨床上腓骨移植后截骨的模式，建立脛骨橫向牽引同期種植的動(dòng)物模型。術(shù)后第八天開始牽引(0.35mm／次x3)，牽引高度為0.7-1.0cm。于第3個(gè)月時(shí)取材，通過普通x線、硬組織切片、組織學(xué)檢查等方法對(duì)牽引區(qū)的成骨情況進(jìn)行檢測，并進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果：山羊脛骨牽引前的

8、平均寬度為11.90mm，牽引后平均寬度為19.35mm。牽引穩(wěn)定期行普通X線觀察結(jié)果顯示：牽引間隙逐漸模糊，種植牽引器與周圍骨結(jié)合緊密。組織形態(tài)學(xué)檢查的結(jié)果顯示：牽引成骨區(qū)新生骨形成明顯，主要為編織骨成分，骨細(xì)胞及骨陷窩較大，有少量不規(guī)則的骨小梁。 4．組織工程化SIS生物膜在牽引成骨中的應(yīng)用研究方法：以成年山羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物建立脛骨垂直牽引同期種植的動(dòng)物模型(共3只，行單側(cè)脛骨垂直向牽引)，將體外構(gòu)建的組織工程化SIS生物膜轉(zhuǎn)移

9、至DID牽引成骨手術(shù)操作的暴露側(cè)(作為實(shí)驗(yàn)組)，以非暴露側(cè)為陽性對(duì)照，以未植入組為陰性對(duì)照。術(shù)后第八天開始牽引(0.35mm／次x3)，牽引高度為0.7-1.3cm。于第3個(gè)月時(shí)取材，Micro-CT、四環(huán)素?zé)晒馊旧⒂步M織切片、組織學(xué)檢查等方法對(duì)牽引區(qū)的成骨情況進(jìn)行檢測，進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察及對(duì)照實(shí)驗(yàn)研究。結(jié)果：山羊脛骨牽引前的平均寬度為12.90mm，牽引后平均寬度為20.15mm。四環(huán)素雙標(biāo)記結(jié)果顯示：原皮質(zhì)骨中四環(huán)素標(biāo)記帶較少，牽引成骨

10、區(qū)新生骨數(shù)量多且兩標(biāo)記帶間的距離較寬，在生物膜植入組的手術(shù)暴露側(cè)與非暴露側(cè)間無明顯差異。Micro-CT結(jié)果顯示：組織工程化SIS生物膜植入組的成骨在牽引暴露側(cè)明顯優(yōu)于未植入組，與手術(shù)非暴露側(cè)者相似。未植入組在Micro-CT成像上幾乎未見新骨形成。組織形態(tài)學(xué)檢查的結(jié)果顯示：牽引成骨區(qū)的手術(shù)未暴露側(cè)與材料植入組均成骨良好，二者新生骨的數(shù)量及質(zhì)量無明顯差異。未植入組成骨較差，部分區(qū)域有骨不連發(fā)生。 【結(jié)論】 1．SIS具有

11、良好的生物相容性和免疫原性，可作為組織工程的支架材料。 2．SIS對(duì)BMSCs的生長和成骨功能無影響，具有良好的細(xì)胞相容性，二者的復(fù)合物植入裸鼠皮下后，異位成骨明顯，以軟骨內(nèi)化骨為主要的成骨方式。作為一種脫細(xì)胞的天然基質(zhì)膜性材料，SIS具有構(gòu)建組織工程化骨膜的可行性。 3．山羊脛骨行橫向牽引同期種植后，骨的寬度明顯增加，牽引種植體與骨結(jié)合良好。但在牽引區(qū)的手術(shù)暴露側(cè)與非暴露側(cè)存在成骨不一致的問題，二者成骨的質(zhì)量與數(shù)量有明