題目一：EBV基因LMP1及BARF1在鼻咽上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化中的作用;題目二：Bmi-1及Mel-18在乳腺癌組織中的表達(dá)相關(guān)性及意義.pdf

1、鼻咽癌是極具地方特色的惡性腫瘤，中國華南地區(qū)尤其是廣東省是鼻咽癌發(fā)病率最高的區(qū)域，是世界低發(fā)地區(qū)的數(shù)十倍。鼻咽癌的發(fā)病原因至今還不十分清楚，普遍認(rèn)為與遺傳，環(huán)境，EBV感染等因素有關(guān)。鼻咽癌發(fā)病過程包括正常-輕度異型增生/化生-重度異型增生/化生-原位癌-浸潤性轉(zhuǎn)移癌等步驟，此外，鼻咽癌也是惡性程度較高的腫瘤，甲．期即可發(fā)牛頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。因此如果對(duì)鼻咽癌的研究有突破，將可能為整個(gè)腫瘤病因?qū)W及發(fā)牛發(fā)展機(jī)制的研究提供一個(gè)具有典型意義的模型

2、。我們實(shí)驗(yàn)室已建立了首個(gè)原本實(shí)驗(yàn)擬用人端粒酶催化亞單位誘導(dǎo)鼻咽上皮永生化，以便建立攜帶癌前病變分子特征的細(xì)胞株，對(duì)于闡明鼻咽癌早期發(fā)生的分子事件具有重要意義，然后在永生化鼻咽上皮的基礎(chǔ)上建立穩(wěn)定表達(dá)LMP1，BARF1的細(xì)胞，研究其惡性轉(zhuǎn)化功能。 研究目的： 建立能反映鼻咽癌癌變過程中不同時(shí)期的模型，為進(jìn)一步闡明鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制提供信息。 實(shí)驗(yàn)方法： 收集非鼻咽癌活檢組織(男性)，原代培養(yǎng)，建立正常鼻咽上

3、皮細(xì)胞，用hTERT誘導(dǎo)鼻咽上皮細(xì)胞永生化。在永生化鼻咽上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上建立穩(wěn)定表達(dá)LMP1和BARF1的細(xì)胞，并且檢測(cè)它們能否惡性轉(zhuǎn)化鼻咽上皮細(xì)胞。 1．細(xì)胞培養(yǎng)：建立永生化的鼻咽上皮細(xì)胞及穩(wěn)定表達(dá)EBV基因LMP1，BARF1的鼻咽上皮細(xì)胞2．Western B10tting：在翻譯水平檢測(cè)各蛋白的表達(dá)3．端粒酶活性測(cè)定：判斷細(xì)胞永生化的標(biāo)志性實(shí)驗(yàn)之一4．端粒長度測(cè)定：判斷細(xì)胞永生化的標(biāo)志性實(shí)驗(yàn)之一5．倍增曲線分析：分析細(xì)胞

4、倍增速率，倍增倍數(shù)6．三維培養(yǎng)：模擬體內(nèi)環(huán)境下的生長方式并分析形態(tài)差異7．侵襲實(shí)驗(yàn)：比較幾種細(xì)胞在侵襲功能上的差異8．生長因子依賴性實(shí)驗(yàn)：比較幾種細(xì)胞對(duì)生長因子的依賴性9．染色體核型分析：判斷細(xì)胞是否有染色體核型改變10．軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)：比較幾種細(xì)胞錨定非依賴性生長方式及集落形成能力實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果： 1．建立了N5-hTERT永生化的鼻咽上皮細(xì)胞N5-hTERT細(xì)胞形態(tài)變小，變圓，有很多小細(xì)胞長出，折光增強(qiáng)，很有活力。

5、但不形成重疊生長。而N5-pBABE細(xì)胞扁平多角形，貼壁生長，細(xì)胞間形態(tài)，大小不一致，在光鏡下細(xì)胞活力不強(qiáng)，存在接觸抑制，未見重疊生長。大約7天左右傳代一次，細(xì)胞傳到第7代左右時(shí)，細(xì)胞就開始出現(xiàn)衰老死亡，細(xì)胞體積變大，形態(tài)不規(guī)則。端粒酶活性結(jié)果顯示，通過外源性hTERT表達(dá)誘使細(xì)胞恢復(fù)端粒酶活性，細(xì)胞端粒和增值活性保持穩(wěn)定， N5-hTERT的端粒酶活性隨著細(xì)胞的永生化顯著增強(qiáng)。端粒長度比N5明顯縮短，但從第10代開始維持穩(wěn)定。倍增曲線

6、結(jié)果顯示N5-hTERT比N5-PBABE生命復(fù)制周期明顯延長，倍增倍數(shù)顯著增加，倍增到80CPD左右。。N5-hTERT在三維培養(yǎng)中主要出現(xiàn)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與N5在三維培養(yǎng)的形態(tài)相近。染色體顯示N5-hTERT-P5染色體依然表現(xiàn)為正常男性染色體， N5-hTERT-P11 染色體為 47，XY，+der(22)t(22；?)，der(?)t(22；?)。22號(hào)染色體出現(xiàn)異常。N5-hTERT在軟瓊脂實(shí)驗(yàn)中未見克隆形成，而軟瓊脂實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)體

7、外惡性轉(zhuǎn)化的重要實(shí)驗(yàn)之一，N5-hTERT無惡變傾向。侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示N5-hTERT不能穿出Transwell小室，我們認(rèn)為N5-hTERT并無惡性轉(zhuǎn)化功能。 2．建立了穩(wěn)定表達(dá)LMP1及BARF1的鼻咽上皮細(xì)胞； 3．LMP1對(duì)N5-hTERT的惡性轉(zhuǎn)化作用三維培養(yǎng)結(jié)果顯示N5-hTERT-LMP1形成形態(tài)不規(guī)則的大克隆，細(xì)胞連接松散，有很多偽足伸出，有向外擴(kuò)張的趨勢(shì)。N5-hTERT-LMP1可導(dǎo)致細(xì)胞出現(xiàn)多倍體，

8、出現(xiàn)多條染色體的易位，缺失，甚至出現(xiàn)四倍體，腫瘤細(xì)胞核型，在Transwell實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞穿出能力比N5-hTERT顯著增強(qiáng)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000)。在完全培養(yǎng)基中，N5-hTFRT-LMP1與N5-hTERT無顯著差別。但是在10﹪EGF，BPE的培養(yǎng)基中，從第5天開始N5-hTERT-LMP1比N5-hTERT的牛長明顯增快(P=0.000)，在無生長因子的培養(yǎng)基中，從第3天開始N5-hTERT-LMP1比N5-hTER

9、T的牛長明顯增快(P=0.001)，表明N5-hTERT-LMP1對(duì)生長因子的依賴性降低，具有惡變傾向。 4．BARF1對(duì)N5-hTERT的惡性轉(zhuǎn)化作用三維培養(yǎng)結(jié)果顯示N5-hTERT-BARG1形成邊緣光滑的大克隆，無偽足伸出。但是BARF1不能引起染色體核型變化。在細(xì)胞侵襲性實(shí)驗(yàn)中，N5-hTERT-BARF1的細(xì)胞能夠穿出Transwell小室，與N5-hTERT差異顯著(P=0.000)。在生長因子依賴性實(shí)驗(yàn)中，N5-h

10、TERT-BARF1與N5-hTERT無顯著差別，但是在10﹪EGF，BPE的培養(yǎng)基中，從第5天開始N5-hTERT-BARF1比N5-hTERT的生長明顯增快(P=0.000)，在無生長因子的培養(yǎng)基中，從第3天開始N5-hTERT-BARF1比N5-hTERT的牛長明顯增快(P=0.013)，表明N5-hTERT-BARF1對(duì)生長因子的依賴性降低，具有惡變傾向。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1．由單基因hTERT誘使鼻咽上皮細(xì)胞永?；?/p>

11、的細(xì)胞，但無惡性轉(zhuǎn)化的功能。關(guān)于hTERT永生化的鼻咽上皮細(xì)胞國內(nèi)外至今尚未見報(bào)道。為我們實(shí)驗(yàn)室在建立永生化鼻咽上皮細(xì)胞的方面進(jìn)一步積累了寶貴經(jīng)驗(yàn)。 2．在N5-hTERT永?；谋茄噬掀ぜ?xì)胞的基礎(chǔ)上，建立了穩(wěn)定表達(dá)LMP1的鼻咽上皮細(xì)胞，這對(duì)于研究鼻咽癌的惡變機(jī)制具有重要意義。 3．在N5-hTERT永生化的鼻咽上皮細(xì)胞的基礎(chǔ)上，建立了穩(wěn)定表達(dá)BARF1的鼻咽上皮細(xì)胞，體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)BARF1能使永生化的鼻咽上皮細(xì)胞惡性

12、轉(zhuǎn)化，這是第一次證實(shí)BARF1能使鼻咽上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步研究EBV的致病機(jī)制提供了前景。 本實(shí)驗(yàn)的研究目的就是探索Mel-18在乳腺癌組織的表達(dá)情況，研究其與臨床資料間的關(guān)系，并分析其預(yù)后意義。 研究目的： 揭示Mel-18在乳腺癌的表達(dá)情況，探討Mel-18與臨床病理特征的關(guān)系，分析其與預(yù)后的關(guān)系，為乳腺癌的預(yù)防，診治，篩查，預(yù)后提供新的信息。 實(shí)驗(yàn)方法： 收集137例乳腺癌組織及30例

13、癌旁組織， 137例癌組織中，有75例標(biāo)本來源于2002年以前的標(biāo)木，62例來源于2004-2005年的標(biāo)本，30例癌旁組織也來源于2002年以前的標(biāo)木。用免疫組織化學(xué)方法對(duì)這些組織進(jìn)行Mel-18與Bmi-1的檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 54(37.9﹪)例癌組織顯示Mel-18陽性，88(64.2﹪)例癌組織顯示Bmi-1陽性，5(3.6﹪)例顯示兩者均陽性。26(86.7﹪)例癌旁

14、組織顯示Mel-18陽性，儀儀13(43.3﹪)例癌旁組織顯示Bmi-1陽性，9(30﹪)例癌旁組織兩者均陽性。103(75.2﹪)例顯示核陽性，34(24.8﹪)例顯示漿陽性。而且Bmi-1在癌巢邊緣表達(dá)高，Mel-18在正常導(dǎo)管組織，癌旁組織比癌組織表達(dá)高。統(tǒng)計(jì)結(jié)果提示，無論在癌旁組織(p=0.000)還是在癌組織(p=0.013)Mel-18與Bmi-1表達(dá)負(fù)相關(guān)。而且Mel-18也與T分期(p=0.001)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.

15、002)，臨床分期(p=0.000)，ER(p=0.005)相關(guān)。Bmi-1與T分期(p=0.025)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(p=0.001)，臨床分期(p=0.000)，ER(p=0.024)， PR(p=0.046)相關(guān)。多因素分析結(jié)果提示聯(lián)合檢測(cè)Mel-18和Bmi-1對(duì)乳腺癌的的預(yù)防，診治，篩查，預(yù)后有意義(p=0.027)。生存曲線顯示乳腺癌組織高表達(dá)Mel-18，病人預(yù)后較好，五年牛存率也較高。高表達(dá)Bmi-l的病人預(yù)后差。