化痰清熱法對(duì)青霉素誘導(dǎo)小鼠癲癇模型的行為學(xué)及GABA、GAD影響實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 癲癇是神經(jīng)內(nèi)科的常見(jiàn)病，嚴(yán)重的影響患者的工作能力和生活質(zhì)量。癲癇是大腦神經(jīng)元突發(fā)性的異常放電，導(dǎo)致短暫的大腦功能障礙的一種慢性疾病。由于異常放電神經(jīng)元所涉及的部位不同，可表現(xiàn)為發(fā)作的運(yùn)動(dòng)、感覺(jué)、植物神經(jīng)、意識(shí)及精神障礙。它是多種原因引起的臨床常見(jiàn)的癥狀之一。據(jù)國(guó)內(nèi)流行病學(xué)調(diào)查，其發(fā)病率約為人群的5％，患病率約為人群的6％～7％。但在所有患者中大約有30％-40％都屬于神經(jīng)內(nèi)科難治性的癲癇，其中50％適用于外科手術(shù)治療，因

2、其發(fā)生的機(jī)制仍不十分清楚。 本課題通過(guò)對(duì)小鼠模型的研究，采用的方法有二：(1)觀察化痰清熱法所產(chǎn)生的急性毒性反應(yīng)和死亡情況。(2)通過(guò)化痰清熱法對(duì)青霉素誘導(dǎo)小鼠癲癇模型的行為和腦電圖；青霉素誘導(dǎo)小鼠的癲癇模型在腦組織中的γ—氨基丁酸(GABA)濃度、谷氨酸脫羧酶(GAD)活性在癲癇的疾病發(fā)生過(guò)程中有密切的關(guān)系。探討化痰清熱法具有抗癲癇作用。 方法： 1．動(dòng)物模型建立與評(píng)定：選用健康的昆明小鼠是由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究

3、中心提供，體重20±2g，雄性小鼠40只，自由飲食3d后。 2．藥物：化痰清熱方是由鮮竹瀝、石菖蒲、當(dāng)歸、遠(yuǎn)志等藥物組成的純中藥粉劑。 3．分組及處理：將40只雄性小鼠，隨機(jī)分4組，每組10只，分別為將該方濃縮為含生藥的中藥制劑，把它制成濃縮液大、小劑量組、苯巴比妥鈉組、生理鹽水組。中藥大、小劑量組各灌胃7d(0.4ml/只)；苯巴比妥鈉組(0.2mg/只)、生理鹽水組各注射腹腔7d(0.25mg/只)。各組動(dòng)物均在早上

4、8：30分分別灌胃及腹腔注射，在8小時(shí)后均腹腔注射東莨菪堿(1mg/kg)30min以拮抗其外周膽堿能反應(yīng)；用青霉素400萬(wàn)U/kg致癇；在成功造模及用藥物治療后。參照Racine標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：分別檢測(cè)腦電圖和觀察癇性發(fā)作行為．分級(jí)：0級(jí)，無(wú)抽搐，行為正常；Ⅰ級(jí)，節(jié)律性嘴或面部抽動(dòng)；Ⅱ級(jí)，點(diǎn)頭或甩尾；Ⅲ級(jí)，單肢抽動(dòng)；Ⅳ級(jí)，多肢抽動(dòng)或強(qiáng)直；Ⅴ級(jí)，全面性強(qiáng)直并伴有陣攣發(fā)作。當(dāng)小鼠持續(xù)性癲癇發(fā)作并連續(xù)在6小時(shí)發(fā)作內(nèi)出現(xiàn)3級(jí)以上即為模型成功。

5、 4．指標(biāo)檢測(cè)： ①對(duì)癲癇組30只隨機(jī)抽出6只，分別為中藥大劑量組、小劑量組、苯巴比妥鈉組；同時(shí)描記腦電圖。用橡皮套套住鼠的4只腳，固定在木板上，再用細(xì)麻繩套住鼠牙以固定頭部。用2根電極，1根插入頂部頭皮下，1根插入同側(cè)耳后皮下，在日本光電5210型10導(dǎo)腦電圖機(jī)上描記腦電活動(dòng)5min。 ②腦組織標(biāo)本采集：取腦組織在電子天平上稱重，按1：10(W：V)加入預(yù)冷的腦組織勻漿液，在超聲勻漿器中破碎(15s×3)，在4℃低溫

6、離心機(jī)中15000×g離心20min，取上清液，置-20℃冰箱保存，3d內(nèi)進(jìn)行GABA濃度和GAD活性檢測(cè)。 ③腦組織勻漿制備：取腦組織在電子天平上稱重，按1：10(W：V)加入預(yù)冷的腦組織勻漿液，在超聲勻漿器中破碎(15s×3)，在4℃低溫離心機(jī)中15000×g離心20min，取上清液，置-20℃冰箱保存，3d內(nèi)進(jìn)行GABA濃度和GAD活性檢測(cè)。 ④腦組織GABA濃度測(cè)定：按Chen等建立的高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)。⑤G

7、AD活性測(cè)定：酶反應(yīng)條件按Wolf等建立的方法進(jìn)行。計(jì)算方法：將同一樣品GAD反應(yīng)后的GABA濃度減去反應(yīng)前GABA濃度，就是每克腦組織所含GAD的活性，即每克腦組織在20min內(nèi)反應(yīng)所生成的GABA的量(μmol/g)。 結(jié)果：造模過(guò)程中癲癇發(fā)作的情況： (1)四組造模小鼠在在8小時(shí)后均腹腔注射東莨菪堿(1mg/kg)30min后，用青霉素400萬(wàn)U/kg致病，分別觀察記錄小鼠出現(xiàn)不同級(jí)別的癲癇發(fā)作。 (2)化

8、痰清熱法對(duì)青霉素鈉誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作的影響：化痰清熱濃縮液中藥大劑量組高于苯巴比妥鈉干預(yù)組，有顯著性的意義(p＜0.05)，而化痰清熱濃縮液中藥小劑量組高于對(duì)照組，有比較顯著性的差異(p＜0．05)。因此說(shuō)明化痰清熱方及苯巴比妥鈉都具有抗癲癇的作用。 (3)化痰清熱方對(duì)青霉素鈉誘導(dǎo)小鼠癲癇發(fā)作級(jí)別的影響：在苯巴比妥鈉腹腔注射7天后，用東莨菪堿和青霉素誘導(dǎo)的小鼠癲癇發(fā)作級(jí)別較中藥大劑量組顯著降低(p＜0.05)，說(shuō)明苯巴比妥鈉抗癲癇

9、干預(yù)起效比較快。當(dāng)化痰清熱方的大、小劑量組給藥7天后比對(duì)照組有顯著性的差異(p＜0.05)，說(shuō)明化痰清熱法中藥小劑量組及苯巴比妥鈉干預(yù)組都均有降低癲癇發(fā)作級(jí)別的作用。 (4)化痰清熱法對(duì)青霉素鈉誘導(dǎo)小鼠顳區(qū)γ—氨基丁酸的影響：正常組與中藥小劑量組顳區(qū)的GABA相比均顯著的降低(p＜0.05)，結(jié)果表明顳區(qū)腦組織GABA濃度升高是由于GAD活性增強(qiáng)所致，可能是癲癇發(fā)作后GABA能神經(jīng)元介入的抑制功能代償性增加的結(jié)果，為機(jī)體內(nèi)源性抗

10、癲癇機(jī)制增強(qiáng)的一種反應(yīng)。當(dāng)用熒光檢測(cè)方法也發(fā)現(xiàn)前腦皮層GAD活性明顯增高，且持時(shí)間較長(zhǎng)。在臨床檢測(cè)方面，侯國(guó)慶等收集未進(jìn)行抗癲癇藥物治療的、24h內(nèi)未發(fā)作的癲癇患者的腦脊液，采用酶化學(xué)反應(yīng)結(jié)合熒光薄層掃描方法，發(fā)現(xiàn)癲癇患者腦脊液中GAD活性明顯增強(qiáng)，病程長(zhǎng)于3年的患者尤為顯著。這些結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，亦認(rèn)為GAD活性增加是機(jī)體的一種代償性反應(yīng)。而在苯巴比妥鈉干預(yù)組，說(shuō)明用藥物能預(yù)防降低小鼠癲癇發(fā)作的機(jī)制。 結(jié)論： 1．