表沒食子兒茶素沒食子酸酯及橙皮苷抑制UVA誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞氧化損傷和凋亡的實驗研究.pdf

1、研究背景： 皮膚是機(jī)體第一道天然保護(hù)屏障，使機(jī)體免受外界物理、化學(xué)物質(zhì)以及微生物侵害，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。角質(zhì)形成細(xì)胞是表皮的主要構(gòu)成細(xì)胞，占表皮細(xì)胞的80％以上，皮膚屏障作用主要是由角質(zhì)形成細(xì)胞完成。長期的紫外線照射不僅引起皮膚光老化而且與皮膚癌的發(fā)生有關(guān)[1]。紫外線(UV)按波長分為長波紫外線(UVA，320～400nm)，中波紫外線(UVB，290～320nm)和短波紫外線(UVC，200～290nm)。UVC被臭氧層阻

2、擋，對人體皮膚幾乎沒有影響；UVB的主要靶部位是表皮，小部分可達(dá)真皮淺層，誘發(fā)紅斑、日曬傷，并和皮膚腫瘤發(fā)生有關(guān)；長波紫外線(UVA)占到達(dá)地球表面紫外線的90％，并且穿透力強(qiáng)，可以穿透表皮進(jìn)入真皮，因此UVA在紫外線對皮膚的損傷中占重要地位。 在對UVA致凋亡作用的研究中，人們認(rèn)為UVA主要是通過ROS來引發(fā)細(xì)胞及其分子氧化損傷而介導(dǎo)的。紫外線誘導(dǎo)皮膚產(chǎn)生的ROS主要有氫氧根(OH-)、超氧陰離子(O2-)、單線態(tài)氧(IO2)

3、和過氧化氫(H2O2)等[3]。ROS可以破壞細(xì)胞蛋白質(zhì)和酶的活性，可以直接或間接引起DNA的氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞壞死和凋亡。線粒體是細(xì)胞能量的動力加工廠。氧自由基可以啟動線粒體的去極化，增加線粒體膜的通透性，使與凋亡相關(guān)的蛋白質(zhì)和酶類釋放入細(xì)胞質(zhì)，激活下游效應(yīng)器誘發(fā)細(xì)胞凋亡[4]。在正常情況下，細(xì)胞內(nèi)存在一系列抗過氧化物酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，它們可清除細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，減輕細(xì)胞氧化損傷。

4、當(dāng)細(xì)胞內(nèi)ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力減弱時可致細(xì)胞損傷，出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。 近年來，天然化合防護(hù)劑己得到普遍關(guān)注。例如，維生素C，E及β-胡蘿卜素已成功應(yīng)用于皮膚保健產(chǎn)品中。傳統(tǒng)中藥綠茶提取物茶多酚(tea polyphenols，TP)中的主要活性成分沒食子兒荼素沒食子酸脂(epigallocatechingallate，EGCG)及橙皮苷(hesperidin，HPD)等有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。鑒于對該兩種活性成

5、分在UVA的光保護(hù)作用中尚不明確，特別是對UVA照射后活性氧的產(chǎn)生和清除、以及線粒體膜電位保護(hù)作用，抑制凋亡未見報道。故本項目旨在探討EGCG以及HPD是否能對UVA誘導(dǎo)的人角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞株)的氧化損傷和凋亡起保護(hù)作用以及其可能作用機(jī)制。籍此可為天然防曬劑的開發(fā)和實際應(yīng)用提供理論依據(jù)和實驗參考數(shù)據(jù)。 目的 觀察EGCG以及HPD對體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞有無毒性作用；觀察UVA照射對HaCaT細(xì)胞及其線粒體

6、的氧化損傷作用；觀察EGCG以及HPD對UVA照射的HaCaT細(xì)胞的光保護(hù)作用，探討其可能作用機(jī)制。 方法 1.細(xì)胞培養(yǎng)：以含10％小牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HacaT細(xì)胞，定量接種于培養(yǎng)皿或96孔板中。 2.紫外線照射：根據(jù)實驗設(shè)計定時定量照射培養(yǎng)細(xì)胞，并分別于UVA照射前后加入相關(guān)藥物進(jìn)行干預(yù)處理。 3.細(xì)胞損傷及細(xì)胞活性檢測： MTT法檢測細(xì)胞增殖活性。 4.細(xì)胞氧化損傷檢測：比色

7、法檢測UVA照射后細(xì)胞上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，總抗氧化能力(the total antioxidation capability)以及丙二醛(MDA)含量變化5.線粒體膜電位變化檢測：流式細(xì)胞儀檢測線粒體膜電位變化6.細(xì)胞凋亡檢測：TUNEL法或流式細(xì)胞儀檢測不同處理條件下細(xì)胞凋亡率。 7.統(tǒng)計學(xué)分析：采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)處理應(yīng)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，P<0.05時差異

8、有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論 本研究結(jié)果顯示：EGCG在≤200μg/ml濃度、HPD在≤320μg/ml時對培養(yǎng)狀態(tài)下的HaCaT細(xì)胞無明顯毒副作用。EGCG和HPD可明顯減輕10J/cm2UVA照射對細(xì)胞增殖的抑制性影響。UVA照射后細(xì)胞的SOD、GSH-Px和總抗氧化能力明顯下降，而EGCG或HPD處理可部分恢復(fù)這些氧化性損傷。加用EGCG和HPD處理細(xì)胞可改善UVA照射降低線粒體膜電位及增強(qiáng)去極化的作用，進(jìn)而減少細(xì)胞凋亡率