表沒食子兒茶素沒食子酸酯及橙皮苷抑制UVA誘導的人角質(zhì)形成細胞氧化損傷和凋亡的實驗研究.pdf

1、研究背景： 皮膚是機體第一道天然保護屏障，使機體免受外界物理、化學物質(zhì)以及微生物侵害，維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。角質(zhì)形成細胞是表皮的主要構(gòu)成細胞，占表皮細胞的80％以上，皮膚屏障作用主要是由角質(zhì)形成細胞完成。長期的紫外線照射不僅引起皮膚光老化而且與皮膚癌的發(fā)生有關[1]。紫外線(UV)按波長分為長波紫外線(UVA，320～400nm)，中波紫外線(UVB，290～320nm)和短波紫外線(UVC，200～290nm)。UVC被臭氧層阻

2、擋，對人體皮膚幾乎沒有影響；UVB的主要靶部位是表皮，小部分可達真皮淺層，誘發(fā)紅斑、日曬傷，并和皮膚腫瘤發(fā)生有關；長波紫外線(UVA)占到達地球表面紫外線的90％，并且穿透力強，可以穿透表皮進入真皮，因此UVA在紫外線對皮膚的損傷中占重要地位。 在對UVA致凋亡作用的研究中，人們認為UVA主要是通過ROS來引發(fā)細胞及其分子氧化損傷而介導的。紫外線誘導皮膚產(chǎn)生的ROS主要有氫氧根(OH-)、超氧陰離子(O2-)、單線態(tài)氧(IO2)

3、和過氧化氫(H2O2)等[3]。ROS可以破壞細胞蛋白質(zhì)和酶的活性，可以直接或間接引起DNA的氧化損傷，導致細胞壞死和凋亡。線粒體是細胞能量的動力加工廠。氧自由基可以啟動線粒體的去極化，增加線粒體膜的通透性，使與凋亡相關的蛋白質(zhì)和酶類釋放入細胞質(zhì)，激活下游效應器誘發(fā)細胞凋亡[4]。在正常情況下，細胞內(nèi)存在一系列抗過氧化物酶，如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等，它們可清除細胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS，減輕細胞氧化損傷。

4、當細胞內(nèi)ROS生成增加、清除ROS能力下降和抗氧化能力減弱時可致細胞損傷，出現(xiàn)細胞凋亡。 近年來，天然化合防護劑己得到普遍關注。例如，維生素C，E及β-胡蘿卜素已成功應用于皮膚保健產(chǎn)品中。傳統(tǒng)中藥綠茶提取物茶多酚(tea polyphenols，TP)中的主要活性成分沒食子兒荼素沒食子酸脂(epigallocatechingallate，EGCG)及橙皮苷(hesperidin，HPD)等有著廣泛的生物學效應。鑒于對該兩種活性成

5、分在UVA的光保護作用中尚不明確，特別是對UVA照射后活性氧的產(chǎn)生和清除、以及線粒體膜電位保護作用，抑制凋亡未見報道。故本項目旨在探討EGCG以及HPD是否能對UVA誘導的人角質(zhì)形成細胞(HaCaT細胞株)的氧化損傷和凋亡起保護作用以及其可能作用機制。籍此可為天然防曬劑的開發(fā)和實際應用提供理論依據(jù)和實驗參考數(shù)據(jù)。 目的 觀察EGCG以及HPD對體外培養(yǎng)的HaCaT細胞有無毒性作用；觀察UVA照射對HaCaT細胞及其線粒體

6、的氧化損傷作用；觀察EGCG以及HPD對UVA照射的HaCaT細胞的光保護作用，探討其可能作用機制。 方法 1.細胞培養(yǎng)：以含10％小牛血清的RMPI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HacaT細胞，定量接種于培養(yǎng)皿或96孔板中。 2.紫外線照射：根據(jù)實驗設計定時定量照射培養(yǎng)細胞，并分別于UVA照射前后加入相關藥物進行干預處理。 3.細胞損傷及細胞活性檢測： MTT法檢測細胞增殖活性。 4.細胞氧化損傷檢測：比色

7、法檢測UVA照射后細胞上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性，總抗氧化能力(the total antioxidation capability)以及丙二醛(MDA)含量變化5.線粒體膜電位變化檢測：流式細胞儀檢測線粒體膜電位變化6.細胞凋亡檢測：TUNEL法或流式細胞儀檢測不同處理條件下細胞凋亡率。 7.統(tǒng)計學分析：采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)處理應用SPSS11.0統(tǒng)計軟件，P<0.05時差異

8、有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論 本研究結(jié)果顯示：EGCG在≤200μg/ml濃度、HPD在≤320μg/ml時對培養(yǎng)狀態(tài)下的HaCaT細胞無明顯毒副作用。EGCG和HPD可明顯減輕10J/cm2UVA照射對細胞增殖的抑制性影響。UVA照射后細胞的SOD、GSH-Px和總抗氧化能力明顯下降，而EGCG或HPD處理可部分恢復這些氧化性損傷。加用EGCG和HPD處理細胞可改善UVA照射降低線粒體膜電位及增強去極化的作用，進而減少細胞凋亡率