表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯對(duì)大鼠脊髓損傷急性期的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、目的:建立第8胸椎(T8)半切型脊髓損傷(spima cord injury,SCI)大鼠模型,并采用過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞作為神經(jīng)損傷的細(xì)胞模型,從抗氧化、抗炎、抗凋亡等方面探討表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(Epigalloeatechin-3-gallate,EGCG)對(duì)脊髓損傷急性期的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。
　　 方法:從在體和離體兩方面來(lái)研究EGCG對(duì)脊髓損傷的

2、影響。
　　 1 在體實(shí)驗(yàn):
　　 (1)半切型脊髓損傷模型的建立及分組與給藥
　　 成年雌性SD大鼠T8處半切脊髓,造成SCI模型后隨機(jī)分為6組:假手術(shù)組(暴露脊髓,但不進(jìn)行半切)、模型組(SCI組)、陽(yáng)性藥組(甲基強(qiáng)的松龍,methyllprednisolone sodiu suecinate,MPSS,100 mg/kg)、EGCG低劑量組(25mg/kg)、EGCG中劑量組(50 mg/kg)、EGCG高

3、劑量組(100 mg/kg)。動(dòng)物SCI術(shù)后5 min,假手術(shù)組和模型組給予生理鹽水(10 ml/kg,ip),其余各組ip給予生理鹽水配制的藥物。
　　 (2)SCI急性期脊髓組織病理組織學(xué)及超微結(jié)構(gòu)的觀察
　　 SCI大鼠給藥24 h后以損傷處為中心取下2 cm脊髓,放入含1 ml多聚甲醛溶液的EP管中避光保存做HE染色的病理切片;以損傷處為中心取下1 cm脊髓,用面刀切成1mm3的小塊置于2.5％0.5 ml的戊二

4、醛溶液中做透射電鏡。
　　 (3)SCI急性期血清炎癥因子的檢測(cè)
　　 SCI大鼠給藥24 h后摘右眼球取血5 ml,取血清,采用ELISA法測(cè)定血清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)含量。
　　 (4)SCI急性期抗氧化酶系統(tǒng)與活性氧簇的測(cè)定
　　 SCI大鼠給藥24 h后取脊髓制備成

5、1％的組織勻漿,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)脊髓中SOD、MDA、O.2-、NO水平。取脊髓組織制備成凝膠電泳樣本,采用Western blot法測(cè)定脊髓中iNOS蛋白表達(dá)水平。
　　 (5)SCI急性期凋亡有關(guān)因子B-細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)的檢測(cè)
　　 SCI大鼠給藥24 h后,取脊髓組織制備成凝膠電泳樣本,采用Western blot法測(cè)定脊髓中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)。<

6、br>　　 (6)SCI急性期內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子營(yíng)養(yǎng)因子-3(NT-3)和腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的測(cè)定
　　 SCI大鼠給藥24 h后,取脊髓組織制備成凝膠電泳樣本,采用Western blot法測(cè)定脊髓中內(nèi)源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子NT-3和BDNF蛋白表達(dá)。
　　 2 離體實(shí)驗(yàn):
　　 (1)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷模型的建立
　　 PC12細(xì)胞以2×105/cm2接種在50 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶,常規(guī)培養(yǎng),

7、培養(yǎng)液每天更換一次,48 h內(nèi)當(dāng)細(xì)胞匯集至80％時(shí)進(jìn)行傳代接種。細(xì)胞加藥處理前采用血清饑餓法使之同步化。加入H2O2(終濃度100～600 μmol/L)孵育2 h,用噻唑藍(lán)(MTT)法確立PC12細(xì)胞損傷模型。
　　 (2)EGCG對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞的保護(hù)作用
　　 細(xì)胞用EG-CG和H2O2處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液,根據(jù)乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒說(shuō)明檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平,用以檢測(cè)細(xì)胞膜通透性及完整

8、性；采用MTT法觀察細(xì)胞線粒體完整性與細(xì)胞活力；收集EGCG和H2O2處理后的細(xì)胞,用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞增殖率；將細(xì)胞接種至內(nèi)有爬片的6孔培養(yǎng)板,孵育、同步化,用EGCG和H2O2處理后,吸棄上清液,每孔加入10 μmol/L BrdU液1 ml,孵育24 h,BrdU免疫熒光法檢測(cè)細(xì)胞周期相S期DNA增生。
　　 (3)EGCG對(duì)H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷的PC12細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制
　　 收集EG-CG

9、和H2O2處理后細(xì)胞,試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)的水平。同時(shí)根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)依次測(cè)定活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)中超氧自由基(O.2-)、羥自由基(-OH)、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性與一氧化氮(NO)含量。采用Western blot檢測(cè)iNOS蛋白水平,采用real timeRT-PCR測(cè)定iNOS-mR

10、NA水平。
　　 結(jié)論:我們采用T8處半切大鼠脊髓造成SCI體內(nèi)損傷模型,以及采用H2O2誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷造成神經(jīng)損傷體外模型,在體與離體給予EGCG干預(yù),通過(guò)生化指標(biāo)及病理的指標(biāo)觀察EGCG對(duì)脊髓損傷的作用,主要結(jié)論如下:
　　 (1)EGCG能保護(hù)SCI大鼠受損脊髓,這種保護(hù)作用源于:減少SCI大鼠血清炎癥因子含量,有顯著抗炎作用；提高SCI大鼠脊髓中抗氧化酶系統(tǒng)活性,抑制氧自由基及iNOS-NO通路的激活而發(fā)揮