表沒食子兒茶素沒食子酸酯對(duì)結(jié)腸癌的預(yù)防作用及其相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、研究背景： 在我國結(jié)腸癌是常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率很高。隨著我國的經(jīng)濟(jì)發(fā)展和人民生活水平的不斷提高，生活方式及膳食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)腸癌的發(fā)病率有逐年上升的趨勢。烹調(diào)的肉類食品中存在多種雜環(huán)胺類(HCAs)致癌和致突變物，HCAs為存在于烤、焙肉和魚中的基因毒化合物，人們幾乎每天都暴露在誘變劑(或致癌劑)雜環(huán)胺類物質(zhì)中。流行病學(xué)的研究表明，當(dāng)人們攝入相對(duì)大量的過熟肉類時(shí)，罹患結(jié)直腸癌的風(fēng)險(xiǎn)顯著升高。其中2-氨基3-甲基咪唑(4，5

2、-f)喹啉(IQ)是雜環(huán)胺類中含量相對(duì)較多的一種，可以導(dǎo)致結(jié)腸腫瘤的基因突變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性，從而具有明顯致癌作用。 雖然現(xiàn)在人們對(duì)結(jié)腸癌的的研究已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是始終不能改變其發(fā)病率高、死亡率高的現(xiàn)狀。目前，由于食物的應(yīng)用方便及無毒害等優(yōu)點(diǎn)，飲食中的化學(xué)防癌物品成為人們研究的熱點(diǎn)，如：姜黃素、萊菔子素、番茄素等。這些物質(zhì)其化學(xué)預(yù)防的作用可能在于：一是有些植物化學(xué)成分能阻止人體內(nèi)致癌物的形成：二是能激活細(xì)胞中的蛋白分子：

3、從而把侵入人體細(xì)胞的致癌物質(zhì)裹起來，并將致癌物排出體外，阻止了致癌物對(duì)細(xì)胞核的損傷，保證了基因的完好。三是能消滅癌癥的初始病灶，抑制癌變區(qū)生長毛細(xì)血管，使癌變部位因缺氧和營養(yǎng)不足而萎縮死亡。四是能促進(jìn)人體淋巴細(xì)胞的形成，淋巴細(xì)胞能參與機(jī)體圍殲癌瘤的戰(zhàn)斗。 茶的保健作用自古以來就有記載，茶多酚是茶葉中三十多種多酚類物質(zhì)的總稱，是一種從綠茶中提取的純天然混合物，主要由四大類物質(zhì)組成，其中以兒茶素最為重要，約占多酚類總量的60～80﹪

4、，兒茶素類主要由表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表兒茶素(EC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)等幾種單體組成，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)的含量最豐富。研究表明：EGCG在體內(nèi)外通過多種信號(hào)途徑抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和促進(jìn)其凋亡，也可以誘導(dǎo)腸道中的Ⅱ相代謝酶，從而起到預(yù)防腫瘤的作用。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(UGT)是化學(xué)物質(zhì)在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化第Ⅱ時(shí)相中最重要的代謝酶，能催化葡萄糖醛酸與多種化學(xué)

5、物質(zhì)進(jìn)行葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)，使其水溶性增加，從而隨尿液和膽汁排出。雖然肝臟微粒體是葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng)的主要部位，但在胃腸道中可以特異地檢測到UGTlA8及IJGTlA10的表達(dá)。胃腸道的葡萄糖醛酸化反應(yīng)是肝臟解毒反應(yīng)的補(bǔ)充，發(fā)揮著胃腸道粘膜的代謝屏障作用。 研究目的： 1．觀察不同濃度EGCG對(duì)致癌物IQ所誘導(dǎo)的裸鼠結(jié)腸粘膜ACF形成的影響，觀察結(jié)腸病理形態(tài)改變，并分析Nrf2和IJGTlAlO的mRNA和蛋白表達(dá)的變化

6、情況，從而探討EGCG預(yù)防結(jié)腸癌前病變的可能分子機(jī)制。 2．首先建立裸鼠皮下HT-29結(jié)腸腫瘤模型，再利用皮下腫瘤組織，建立裸鼠結(jié)腸原位腫瘤模型，觀察不同濃度EGCG對(duì)結(jié)腸腫瘤原位生長、腹膜轉(zhuǎn)移、腹水形成、肝肺轉(zhuǎn)移的抑制作用，分析腫瘤組織內(nèi)Nrf2、LIGTlA、LJGTlA8和UGTlA10的mRNA和蛋白表達(dá)的變化情況，探討EGCG是否通過誘導(dǎo)UGTlA及其同工酶的表達(dá)而起到預(yù)防結(jié)腸癌的原位生長與轉(zhuǎn)移的作用。 3．體

7、外封閉HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞中Nrf2基因的表達(dá)，用低表達(dá)Nrf2基因的FrF-29結(jié)腸癌細(xì)胞建立裸鼠皮下腫瘤模型，然后建立裸鼠結(jié)腸原位腫瘤模型，觀察不同濃度EGCG對(duì)結(jié)腸腫瘤原位生長、腹膜轉(zhuǎn)移、腹水形成、肝肺轉(zhuǎn)移的抑制作用，分析腫瘤組織內(nèi)Nrf2、LIGTlA、LJGTlA8和IJGTlAl0的mRNA和蛋白表達(dá)的變化情況，探討Nrf2基因在EGCG誘導(dǎo)UGTlA及其同工酶的表達(dá)中的橋梁作用。 研究方法： 1-用致癌物I

8、Q誘導(dǎo)裸鼠結(jié)腸粘膜隱窩發(fā)生畸變的動(dòng)物模型，觀察低、中、高劑量不同濃度EGCG(5，10和20mg/kg．d)預(yù)先作用于小鼠后，0.2﹪亞甲藍(lán)染色觀察ACF數(shù)目及畸變隱窩(AC)的數(shù)目，HE染色觀察結(jié)腸粘膜組織的病理改變，免疫組化和Western-Blotting檢測結(jié)腸組織中Nrf2基因的蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測Nrf2和UGTlA10基因的mRNA表達(dá)水平，分析ACF的形成與Nrf2和IJGTlAlO基因表達(dá)間的關(guān)系。

9、2．體外常規(guī)培養(yǎng)HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，在裸鼠皮下建立腫瘤模型，反復(fù)傳代5次，切下皮下腫瘤，建立裸鼠結(jié)腸原位腫瘤模型，觀察低、中、高劑量不同濃度EGCG(5，10和20mg/kg.d)預(yù)先作用于小鼠后，肉眼觀察有無腹膜轉(zhuǎn)移、腹水形成，HE染色觀察肝肺組織的病理學(xué)改變，免疫組化和Western-blotting檢測大腸組織中Nrf2基因的蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測Nrf2、UGTlA、LJGTlA8和UGTlA10基因的mR

10、NA表達(dá)水平，分析不同劑量EGCG對(duì)裸鼠結(jié)腸原位生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，及其對(duì)Nrf2、UGTlA、UGTlA8和UGTlA10基因的誘導(dǎo)表達(dá)作用。 3．利用RNA干擾技術(shù)封閉Nrf2基因的表達(dá)，建立低表達(dá)Nrf2基因的HT-29結(jié)腸癌細(xì)胞系，培養(yǎng)其至對(duì)數(shù)生長期，在裸鼠皮下建立腫瘤模型，反復(fù)傳代5次，切下皮下腫瘤，建立裸鼠結(jié)腸原位腫瘤模型，觀察低、中、高劑量不同濃度EGCG(5，10和20mg/kg．d)預(yù)先作用于小鼠后，肉眼觀察

11、有無腹膜轉(zhuǎn)移、腹水形成，HE染色觀察肝肺組織的病理學(xué)改變，免疫組化和Western-blotting檢測腫瘤組織中Nrf2基因的蛋白表達(dá)水平，RT-PCR檢測Nrf2、UGTlA、UGTlA8和UGTlA10基因的mRNA表達(dá)水平，分析不同劑量EGCG對(duì)裸鼠結(jié)腸原位生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用，反向驗(yàn)證Nrf2在不同劑量EGCG誘導(dǎo)UGTlA、UGTlA8和UGTlA10基因的誘導(dǎo)表達(dá)中的作用。 4．統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)

12、軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料的數(shù)據(jù)均以Means±SD表示，對(duì)成組設(shè)計(jì)的多個(gè)樣本均數(shù)的比較，進(jìn)行方差分析；計(jì)數(shù)資料的數(shù)據(jù)均以﹪表示，對(duì)所得計(jì)數(shù)資料進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。P<0.05為差異有顯著性。 研究結(jié)果： 1.IQ處理組裸鼠的體重明顯下降，結(jié)腸粘膜呈現(xiàn)高度不典型增生并形成大量ACF。不同濃度EGCG處理后，裸鼠體重明顯上升，病理改變趨于正常，ACF數(shù)目明顯下降，免疫組化和免疫印跡檢測大腸組織Nrf2蛋白表達(dá)水平明顯高于IQ組(P<

13、0.05)，且在免疫組化中發(fā)現(xiàn)Nrf2有核轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，RT-PCR檢測Nrf2和LIGT1A10的mRNA表達(dá)水平明顯高于IQ組(P<0.05)。 2．用HT-29結(jié)腸腫瘤細(xì)胞建立結(jié)腸原位腫瘤模型組的裸鼠有少數(shù)發(fā)生惡液質(zhì)及消瘦的現(xiàn)象，不同劑量EGCG處理后，裸鼠體重上升，并明顯抑制結(jié)腸原位腫瘤的生長及多處轉(zhuǎn)移(腹膜、腹腔和肝肺)，免疫組化和免疫印跡檢測腫瘤組織Nrf2基因的蛋白表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0.05)，且在免疫組化中

14、發(fā)現(xiàn)Nrf2有核轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象，RT-PCR檢測Nrf2、IJGTlA、UGT1A8和LJGT1A10基因的mRNA表達(dá)水平明顯高于模型組(P<0.05)。 3．用HT-29-siNrf2結(jié)腸腫瘤細(xì)胞建立結(jié)腸原位腫瘤的各組裸鼠，體重?zé)o明顯差異，不同劑量EGCG處理后，并無明顯抑制結(jié)腸原位腫瘤的生長及多處轉(zhuǎn)移(腹膜、腹腔和肝肺)，免疫組化和免疫印跡檢測腫瘤組織Nrf2基因的蛋白表達(dá)水平與模型組比較無明顯差異(P<0.05)，RT-PCR

15、檢測Nrf2、LIGT1A、LIGT1A8和UGT1A10基因的mRNA表達(dá)水平與模型組比較無明顯差異(P>0.05)。 研究結(jié)論： 1.不同劑量EGCG能抑制IQ誘導(dǎo)的裸鼠結(jié)腸ACF的形成，進(jìn)而預(yù)防結(jié)腸癌的發(fā)生，并且有劑量依賴效應(yīng)，這種作用可能是通過誘導(dǎo)Nrf2和LJGT1A10基因的表達(dá)，從而增加腸粘膜對(duì)IQ的清除，減少IQ誘導(dǎo)的ACF形成來實(shí)現(xiàn)的。 2．不同劑量．EGCG能夠抑制裸鼠HT-29結(jié)腸原位腫瘤的

16、局部生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，并且有劑量依賴效應(yīng)，這種作用可能是通過誘導(dǎo)Nrf2、IJGT1A、LIGT1A8和UGT1A10基因的表達(dá)，從而增加腸粘膜對(duì)腫瘤組織的抵抗性(局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移)。 3．與模型組(低表達(dá)Nrf2的結(jié)腸腫瘤細(xì)胞系建立的結(jié)腸原位腫瘤)相比，不同劑量EGCG對(duì)結(jié)腸原位腫瘤的局部生長和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移均無明顯抑制作用，也并不能明顯誘導(dǎo)Nrf2、UGTlA、UGTlA8和LJGTlA10基因的表達(dá)，說明Nrf2在EGCG誘導(dǎo)U

17、GTlA及其同工酶表達(dá)中起到關(guān)鍵作用。研究意義： 1．本研究證實(shí)了不同劑量EGCG可以抑制IQ誘導(dǎo)的結(jié)腸ACF的形成，構(gòu)建了結(jié)腸癌植物化學(xué)保護(hù)劑的動(dòng)物模型，為結(jié)腸癌預(yù)防的體內(nèi)研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 2．本研究證實(shí)了不同劑量EGCG可以抑制裸鼠結(jié)腸原位腫瘤的局部生長和多處轉(zhuǎn)移，并且率先在結(jié)腸原位腫瘤模型中提出了EGCG可以誘導(dǎo)Nrf2-UGTlA信號(hào)通路中基因表達(dá)的作用，這為模擬人體內(nèi)結(jié)腸腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，探求結(jié)腸腫瘤的植物化