四氨基金屬酞菁—Fe-,3-O-,4-納米復(fù)合粒子固定化漆酶及其在光纖腎上腺素傳感器中的應(yīng)用.pdf

1、有機(jī)-無(wú)機(jī)納米復(fù)合材料是無(wú)機(jī)納米粒子和有機(jī)物在納米尺度上復(fù)合而成的新型材料，將這類(lèi)材料應(yīng)用于生命和信息科學(xué)領(lǐng)域，是一個(gè)非常吸引人的研究方向。本學(xué)位論文根據(jù)光纖生物傳感器和臨床醫(yī)學(xué)檢測(cè)存在的主要問(wèn)題，利用有機(jī)一無(wú)機(jī)納米復(fù)合技術(shù)和酶固定化技術(shù)，制備了有機(jī)一無(wú)機(jī)納米復(fù)合粒子固定化酶，并將其應(yīng)用于基于酶催化的耗氧型光纖傳感器，實(shí)現(xiàn)了人體中非常重要的神經(jīng)遞質(zhì)腎上腺素的檢測(cè)。 本學(xué)位論文在以下幾個(gè)方面進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。第一，選擇四氨基金屬酞

2、菁(MTAPc，M=Cu，Co)和Fe<,3>O<,4>納米粒子制備了有機(jī)一無(wú)機(jī)納米復(fù)合材料，研究了它們的結(jié)構(gòu)與性能，尤其是作為載體材料的性能。第二，研究了血紅密孔菌漆酶的催化性能，并以MTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子為載體固定了漆酶，研究了固定化的最優(yōu)化條件和固定化漆酶的性能。第三，研究了漆酶催化腎上腺素的機(jī)理和漆酶一介體體系中漆酶催化腎上腺素的機(jī)理，測(cè)定了固定化漆酶催化腎上腺素的最適條件。第四，制備了光學(xué)氧傳感膜，設(shè)計(jì)

3、和構(gòu)建了基于漆酶催化的光纖腎上腺素生物傳感器，研究了傳感器的原理和使用條件，對(duì)腎上腺素進(jìn)行了檢測(cè)。 本論文的主要結(jié)論包括以下幾個(gè)方面： (1)采用化學(xué)共沉淀法制備了平均粒徑為10nm的Fe<,3>O<,4>納米粒子，合成了兩種MTAPc(M=Cu，Co)，利用原位復(fù)合法制備了MTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子。用IR、XRD、XPS、SEM和粒徑儀對(duì)納米復(fù)合粒子進(jìn)行了表征，表明形成了MTAPc以分子分散層包覆

4、在Fe<,3>O<,4>納米粒子表面的復(fù)合粒子。納米復(fù)合粒子的磁性能、熱穩(wěn)定性、抗氧化能力、溶解性能、貯存穩(wěn)定性的研究結(jié)果表明，MTAPc包覆層大大提高了Fe<,3>O<,4>納米粒子的穩(wěn)定性。MTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子的磁性能、比表面積、孔徑、穩(wěn)定性等性質(zhì)，表明它們適合用作載體固定生物活性分子。 (2)以ABTS為底物研究了血紅密孔菌漆酶的催化性能，在酒石酸緩沖溶液中它的最適催化pH值和溫度分別為3.0和5

5、5℃，米氏常數(shù)Km值為12.6州，這說(shuō)明血紅密孔菌漆酶是一種催化性能較好的漆酶。用UV光譜和循環(huán)伏安測(cè)試研究了漆酶催化腎上腺素氧化的機(jī)理，催化反應(yīng)的最終產(chǎn)物是腎上腺素紅，最適催化pH值和溫度分別是5.0和50℃，最適緩沖液濃度為0.1M，Kn值為37.5μM。在漆酶-ABTS介體體系中，游離漆酶催化腎上腺素氧化的機(jī)理研究表明催化反應(yīng)是由四個(gè)化學(xué)反應(yīng)組成的，腎上腺素紅的生成速度不僅與每個(gè)反應(yīng)的速度常數(shù)有關(guān)，還與漆酶、介體、底物的濃度有關(guān)。

6、UV光譜表明，加入介體以后，腎上腺素紅的生成速度明顯提高。 (3)CuTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子和CoTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子做載體時(shí)，不參與漆酶的催化反應(yīng)，固定化反應(yīng)最優(yōu)條件是相同的。用共價(jià)交聯(lián)法固定了漆酶，固定化反應(yīng)是四步的過(guò)程，對(duì)100mg復(fù)合粒子，最優(yōu)條件分別是：戊二醛活化反應(yīng)pH值6.0，反應(yīng)時(shí)間4h，戊二醛用量0.2g；牛血清白蛋白(BSA)交聯(lián)反應(yīng)pH分別是8.0和6.0，BS

7、A用量2.5mg；漆酶交聯(lián)反應(yīng)pH 5.0，溫度0℃，反應(yīng)時(shí)間1h。以2mg/mL漆酶磷酸緩沖液進(jìn)行固定，漆酶的固定化率可達(dá)到20％：ABTS為底物時(shí)，固定化漆酶的催化能力是1430U/g，固定化漆酶的Km值為23.8μM。以ABTS為底物，固定在CuTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子和CoTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子上的固定化漆酶的最適催化條件相同，分別為pH值3.O，溫度是45℃。弱酸性條件下固定化漆酶催化

8、腎上腺素的反應(yīng)產(chǎn)物是腎上腺素紅，最適催化pH和溫度分別是5.0和55℃；在漆酶一介體體系中，pH 5.0時(shí)固定化漆酶催化腎上腺素的最終產(chǎn)物隨腎上腺素濃度不同而不同。 (4)采用包埋法用醋酸纖維素(CA)固定釕(Ⅱ)-聯(lián)吡啶制備了光學(xué)氧傳感膜，制備的最優(yōu)條件是成膜溫度為15-25℃，最佳配比為：0.10g CA，3.5mL丙酮和0.2 mL水，指示劑濃度8 mg/mL。光學(xué)氧傳感膜對(duì)溶解氧濃度檢測(cè)的傳感特征曲線(xiàn)表明tanФ。/ta

9、nФ與溶解氧濃度存在較好的線(xiàn)性關(guān)系；光學(xué)氧傳感膜的檢測(cè)下限為0.5mg/L，響應(yīng)時(shí)間t≤60s，具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，但光學(xué)氧傳感膜的使用溫度不能超過(guò)40℃。 (5)設(shè)計(jì)和構(gòu)建了基于熒光猝滅效應(yīng)的光纖腎上腺素生物傳感器測(cè)試系統(tǒng)，以固載在CuTAPc-Fe<,3>O<,4>納米復(fù)合粒子上的固定化漆酶為催化劑，ABTS為介體，研究漆酶一介體體系滯后相移曲線(xiàn)的變化。在光纖腎上腺素生物傳感器中固定化酶的活力、ABTS的濃度都對(duì)腎上腺