納米TiO2處理對家蠶先天免疫調節(jié)機制的影響.pdf

1、家蠶（Bombyx mori）是鱗翅目的模式昆蟲，也是重要的經濟昆蟲。在漫長的進化過程中，家蠶和其它鱗翅目昆蟲一樣形成了一套獨特的先天免疫系統(tǒng)，包括體液免疫和細胞免疫。其中體液免疫主要包括各種識別受體、胞內信號因子、抗菌肽、蛋白酶以及酶級聯反應等。由于沒有后天免疫系統(tǒng)，家蠶主要通過先天免疫系統(tǒng)克服外界不良環(huán)境的影響以及抵抗外源微生物的侵染，如何提高家蠶對外界病原微生物的免疫力一直是蠶業(yè)研究領域的熱點和難點。在哺乳動物中的研究結果表明，納

2、米粒子（Nanoparticles，NPs）能通過改變免疫細胞活性、非特異性提高或降低免疫反應，進而參與免疫調節(jié)以及激活相關補體系統(tǒng)這三種方式影響機體的先天免疫系統(tǒng)，但是納米粒子是否會影響家蠶的先天免疫系統(tǒng)還未有研究報道。
　　已有研究表明納米二氧化鈦（Titanium dioxide nanoparticles,TiO2NPs）具有抗菌功能，不僅抗菌效果持久，而且抗菌譜廣。銳鈦礦型 TiO2 NPs對大腸桿菌（Escherich

3、iacoli）、綠膿桿菌（Pseudomonas aeruginosa）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、芽桿菌（Bud bacillus）、曲霉（Aspergillus）以及沙門氏菌（Salmonella）等均具有很強的殺滅效果；低劑量（5 mg/L）的TiO2NPs，可以促進家蠶的生長，提高家蠶的飼料效率，提高蠶絲產量和質量，還可以提高家蠶對有機磷農藥及家蠶核型多角體病（Bombyx morinucle

4、opolyhedrovirus,BmNPV）的抵抗性，但尚未進一步研究其對家蠶先天免疫系統(tǒng)的影響。因此，本研究采用5 mg/L的TiO2 NPs預處理家蠶，以家蠶黑胸敗血病和BmNPV為感染源，在分子水平和蛋白水平研究了TiO2 NPs對家蠶先天免疫系統(tǒng)的影響，獲得了以下研究結果：
　　1. TiO2 NPs處理后家蠶中腸數字基因表達譜分析
　　為了獲得TiO2 NPs預處理后的基因表達譜，本研究對五齡第3天家蠶中腸組織進行

5、了數據基因表達譜（Digital gene expression profile,DGE）檢測。結果表明，TiO2 NPs預處理后，1105個基因發(fā)生了4.00倍以上的顯著差異，上調基因526個，下調基因579個，其中42個基因涉及15條通路的調節(jié)發(fā)生了顯著差異（P<0.05），其中涉及酪氨酸代謝（Tyrosine metabolism）的5個基因最高上調了12739.00倍，最低的上調了33.47倍，涉及黑色素合成（Melanogen

6、esis）的4個基因最高上調了1148.00倍，最低上調了33.47倍。根據基因的GO（Gene Ontology）注釋和KEGG（Kyoto Encyclopedia Of Genesand Genomes）通路分析，差異表達的基因主要參與了免疫應答（Immune response），防御反應（Defense response），能量代謝（Energy metabolism）和凋亡（Apoptosis）等代謝通路。免疫應答中編碼MAP

7、激酶-ERK激酶的基因轉錄水平上調了65.80倍，防御反應中編碼Moricin I，肽聚糖識別蛋白S6和β-1,3-葡聚糖結合蛋白前體的基因轉錄水平分別上調了97.68倍，2.68倍和2.16倍，凋亡調控中編碼負向調控凋亡蛋白GF12231的基因轉錄水平上調了48.84倍。結果表明，TiO2 NPs處理能促進家蠶先天免疫系統(tǒng)中的酪氨酸代謝、黑色素形成以及抗菌肽Moricin I的表達，抑制家蠶細胞凋亡的發(fā)生，為研究TiO2 NPs對家蠶

8、先天免疫系統(tǒng)的影響以及將TiO2 NPs應用于蠶病防治提供了有力的數據支撐。
　　2.體外條件下TiO2 NPs對家蠶黑胸敗血菌的抑制效果
　　為了探討在體外條件下TiO2NPs對家蠶黑胸敗血菌（Bacillus bombyseptieus，Bb）的作用效果，本研究測定了家蠶黑胸敗血菌與濃度分別為0mg/L，5 mg/L，50 mg/L和100 mg/LTiO2NPs孵育后的生長曲線，結果表明TiO2NPs能抑制黑胸敗血菌的

9、增殖，且具有劑量效應，TiO2 NPs濃度越高，抑制作用越顯著。此外，TiO2 NPs與黑胸敗血菌作用不同時間后的毒力檢測，結果表明TiO2 NPs對黑胸敗血菌的抑制作用具有時間效應，作用時間越長，抑制效果越明顯；即TiO2 NPs能抑制黑胸敗血菌的增殖，且呈現了劑量效應和時間效應。
　　3. TiO2 NPs處理對家蠶酚氧化酶活性影響和黑胸敗血病的抑制效果
　　DGE數據分析可知TiO2 NPs能促進家蠶的酪氨酸代謝和黑色

10、素形成，本研究進一步對血淋巴中酚氧化酶活力進行了檢測，結果顯示，TiO2 NPs處理能將PPO酶原活力提高10.43％。qRT-PCR檢測了酚氧化酶級聯關鍵基因Mapk-Erk，PGRP-S2和BmPPO1，Toll免疫通路關鍵基因βGRP3，PGRP-S2和Rel，Imd免疫通路關鍵基因βGRP4，PGRP-S3和Imd以及抗菌肽Moricin I的基因轉錄水平，發(fā)現TiO2NPs預處理組與水處理組相比均呈現了不同程度上調，最高上調了

11、525.43倍，最低上調2.00倍。通過注射感染黑胸敗血菌，發(fā)現TiO2 NPs預處理組家蠶的存活率提高了13.30%；qRT-PCR結果顯示，TiO2 NPs降低了家蠶黑胸敗血菌引起的酚氧化酶級聯、Toll和Imd通路活化水平。RT-PCR檢測BmCaspase3基因轉錄水平發(fā)現TiO2 NPs不僅抑制了家蠶自身細胞凋亡的發(fā)生，且能抑制家蠶黑胸敗血菌感染引起的細胞凋亡。這些結果表明，TiO2 NPs通過促進家蠶先天免疫系統(tǒng)中的酚氧化酶

12、級聯、Toll和Imd通路的活化水平和上調抗菌肽Moricin I的表達的途徑增強家蠶對黑胸敗血病的免疫，此外，它還能抑制家蠶細胞凋亡的發(fā)生。
　　4. TiO2 NPs提高家蠶對BmNPV的抗性機制
　　本研究通過添食家蠶TiO2 NPs，研究其對BmNPV抗性的影響，分析了BmNPV在家蠶中腸內的增殖特征以及家蠶抗BmNPV和免疫調節(jié)相關基因的轉錄差異。結果表明，低劑量的TiO2 NPs添食家蠶，可以提高家蠶對BmNPV

13、的抗性，實驗組和對照組144 h的死亡率分別是0.56%和8.33%，TiO2NPs預處理顯著降低了死亡率。BmNPV在中腸內的增殖特征分析表明，實驗組和對照組在感染BmNPV后72 h開始明顯增殖，對照組在120 h達到最高峰，實驗組在144 h才達到最高峰，高峰值相差12.63倍，表明家蠶添食TiO2 NPs可以抑制BmNPV在中腸內增殖，中腸中受BmNPV誘導的家蠶抗BmNPV基因Bmlipase-1的轉錄特征也和BmNPV的增殖

14、規(guī)律一致。免疫信號通路分析表明，添食 TiO2 NPs抑制家蠶體內 BmNPV的增殖進而可以降低JAK/STAT和PI3K-Akt的激活水平，但可以促進基因Bmakt的表達，提高家蠶自身的免疫力。這些結果表明，TiO2 NPs提高家蠶對 BmNPV的抗性的機制是通過抑制BmNPV在家蠶體內的增殖以及提高自身免疫來實現的。
　　5. TiO2 NPs對家蠶BmN細胞的影響
　　本研究以家蠶卵巢細胞（BmN）為研究對象，檢測了濃

15、度為1.25 mg/L，2.5 mg/L，5mg/L，10mg/L，50 mg/L和100 mg/L的TiO2NPs處理對BmN細胞增殖的影響，結果發(fā)現，TiO2NPs能促進BmN細胞的增殖，且呈現了劑量效應，在100 mg/L濃度范圍內，TiO2NPs濃度越高，促進作用越明顯。此外，本研究還檢測了5 mg/L TiO2 NPs對BmN細胞活性氧（Reactive oxygen species,ROS）水平的影響，結果發(fā)現TiO2 NP

16、s能顯著降低BmN細胞的ROS水平。
　　本課題研究了TiO2 NPs對家蠶先天免疫調節(jié)機制的影響，獲取了TiO2 NPs處理后家蠶五齡第3天中腸組織的基因表達譜，闡明了TiO2 NPs通過促進家蠶的酚氧化酶級聯、Toll和Imd通路的活化水平以及上調抗菌肽Moricin I表達的途徑增強家蠶對黑胸敗血病的抗性，通過抑制BmNPV在家蠶體內的增殖以及提高自身免疫的途徑增強家蠶對BmNPV的抗性。本研究闡明了TiO2 NPs對家蠶先