透明質酸和羥丙基甲基纖維素對滴眼液常用防腐劑誘導人結膜上皮細胞DNA損傷保護及修復機理研究.pdf

1、本文從以下幾部分進行了闡述。
　　第一部分常用防腐劑硫柳汞以及過硼酸鈉誘導人結膜上皮細胞DNA損傷的研究。
　　目的:
　　硫柳汞(Thimerosal，Thi)是目前臨床使用的滴眼液中常添加的防腐劑，過硼酸鈉是主要用于人工淚液中的新型氧化型低毒防腐劑。本研究擬探討硫柳汞和過硼酸鈉對體外培養(yǎng)的人結膜上皮細胞DNA損傷、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、細胞存活率的影響。
　　方法:

2、
　　將細胞分為二組，用濃度為0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％的硫柳汞和過硼酸鈉分別作用于體外培養(yǎng)的人結膜上皮細胞30分鐘。應用甲基偶氮唑藍比色法（MTT法）檢測細胞存活率;堿性彗星實驗用于檢測以DNA單鏈斷裂(DNA single-strand breaks，SSBs)為主的DNA損傷;用免疫熒光法檢測細胞核內磷酸化的H2AX(γH2AX)焦點形成，以評估以DNA雙鏈斷裂(DNAd

3、ouble-strand breaks，DSBs)為主的DNA損傷情況及嚴重程度;以乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)為探針，應用流式細胞儀檢測細胞內ROS水平。
　　結果：
　　MTT結果表明，0.001％硫柳汞可導致顯著的細胞存活率下降(P＜0.001)。而堿性彗星實驗則顯示，0.00005％～0.001％的硫柳汞均可導致顯著的細胞核SSBs(P＜0.001)。免疫熒光法也發(fā)現(xiàn)不同濃度的硫柳汞處理后結膜上皮細胞細胞核內

4、含有γH2AX焦點的細胞比例及焦點數(shù)均較對照組顯著增加(P＜0.05)，表明硫柳汞可導致細胞核DSBs形成。隨濃度的增加，硫柳汞所致的DNA損傷加重。流式細胞儀檢測表明，不同濃度硫柳汞處理后的人結膜上皮細胞內ROS水平較對照組增高，差異有顯著性(P＜0.001)。與DNA損傷不同的是，0.001％濃度組產生的ROS水平較0.0005％組低，這可能和細胞生存率的下降有關。而過硼酸鈉作用于人結膜上皮細胞30分鐘后細胞生存率無變化，0.001

5、％濃度組可引起明顯DSBs和SSBs，且可引起細胞內ROS水平增高，過硼酸鈉在各個濃度組引起的ROS水平升高均小于硫柳汞。
　　結論：
　　硫柳汞可導致人結膜上皮細胞細胞核DNA損傷并影響細胞活性。硫柳汞所致的細胞內ROS增加可能與DNA損傷相關。過硼酸鈉不影響細胞生存率，高濃度可引起DNA損傷以及細胞內ROS水平增高，過硼酸鈉對結膜上皮細胞的DNA毒性小于硫柳汞。
　　第二部分透明質酸和羥丙基甲基纖維素對硫柳汞所致人

6、結膜上皮細胞DNA損傷抗氧化保護作用的研究。
　　目的：
　　透明質酸(hyaluronan，HA)以及羥丙基甲基纖維素(hydroxypropylmethylcellulose，HPMC)是廣泛應用于眼科臨床治療干眼癥患者所用的人工淚液替代物。本研究擬探討HA以及HPMC對硫柳汞引起的對體外培養(yǎng)的人結膜上皮細胞DNA損傷、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、細胞存活率下降的保護作用。
　

7、　方法：
　　將細胞分為3組，一組采用濃度分別為0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％的硫柳汞單獨處理30min，另兩組分別用0.3％ HA或者0.3％ HPMC預處理30分鐘再給予相同的硫柳汞處理。用MTT法檢測細胞存活率，堿性彗星實驗和免疫熒光法檢測細胞核內磷酸化的H2AX(γH2AX)焦點檢測DNA損傷，以乙酰乙酸雙氯熒光素(DCFH-DA)為探針，應用流式細胞儀檢測細胞內ROS水平

8、。
　　結果：
　　MTT結果表明，使用0.001％硫柳汞處理30分鐘后，細胞生存率出現(xiàn)明顯下降。各個濃度引起的DNA單鏈或雙鏈斷裂以及細胞內ROS水平升高基本呈劑量效應，然而，細胞用0.3％ HPMC或0.3％ HA預處理30分鐘后，與單獨硫柳汞處理組比較，可以顯著提高細胞生存率，降低DNA損傷以及細胞內ROS水平，且HA的抗氧化細胞保護作用要優(yōu)于HPMC。
　　結論：
　　硫柳汞可引起角膜上皮細胞DNA損傷，

9、氧化應激可能為其機制。HA以及HPMC具有抗氧化作用，可抑制硫柳汞引起的DNA損傷，從而可在淚液替代成分的作用之外發(fā)揮眼表保護作用，且HA的保護作用要優(yōu)于HPMC。
　　第三部分硫柳汞急性暴露所致人結膜上皮細胞DNA損傷修復機理的研究。
　　目的：
　　在前期的實驗中，已證實硫柳汞短期暴露可引起眼表上皮細胞DNA損傷以及ROS產生增加。本研究擬檢測給予細胞24h修復后的細胞凋亡、細胞周期分布、線粒體膜電位以及相關靶蛋白

10、的表達，探討硫柳汞急性暴露后細胞的DNA損傷修復機制。
　　方法：
　　將細胞先用0.00001％、0.00005％、0.0001％、0.0005％及0.001％硫柳汞處理30min之后洗去藥液，換上新鮮培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)24h后，檢測細胞形態(tài)以及細胞生存率、用流式細胞儀檢測細胞周期分布，細胞凋亡，線粒體膜電位，用western blot檢測凋亡蛋白PARP、Caspase3以及自噬蛋白LC-3的表達情況。
　　結果：

11、r>　　用硫柳汞處理30min后，并未引起明顯的細胞凋亡，而在24h修復后，0.0005％-0.001％組卻出現(xiàn)了明顯的細胞凋亡(p＜0.001)，流式細胞儀檢測顯示處理30min后0.0005％-0.001％組線粒體膜電位出現(xiàn)明顯下降(p＜0.001)，24h后細胞周期出現(xiàn)了G2M期阻滯，Western blot結果顯示凋亡標志蛋白PARP以及caspase3出現(xiàn)活化片段，自噬標志蛋白LC-3也出現(xiàn)了活化片段。
　　結論：