基于拉曼光譜的地中海貧血紅細胞判別和攜氧功能研究.pdf

1、紅細胞是血液中數(shù)量最多的一種細胞，在人體新陳代謝和氣體運輸方面起著非常重要的作用，其機能主要由胞內(nèi)的血紅蛋白完成。而外部環(huán)境的變化，如滲透壓、藥物處理、氧氣分壓等可能引起紅細胞內(nèi)血紅蛋白分子構(gòu)象發(fā)生變化。研究紅細胞及其血紅蛋白的結(jié)構(gòu)和功能有助于深入了解紅細胞的攜氧功能甚至血液疾病的病理，為診斷和治療提供理論依據(jù)。地中海貧血（簡稱地貧）是一種由于珠蛋白基因缺失或缺陷使珠蛋白鏈的合成受到部分或完全抑制而引起的遺傳性溶血性貧血。該疾病在我國南

2、方地區(qū)發(fā)病率較高，主要分為α-地貧和β-地貧兩種類型。目前尚無有效的根治方法，只能篩查地貧患者，避免重型地貧患兒的出生以控制該病的蔓延。但常規(guī)的基于細胞群體或血紅蛋白的檢測方法，操作繁瑣，工作量大，費用相對昂貴，不適合大面積人群的篩查。此外，研究指出地貧紅細胞結(jié)構(gòu)的變化在攜氧能力上也表現(xiàn)出差異。因此，發(fā)展一種快速簡便、低成本的地貧檢測方法，及監(jiān)測紅細胞的氧合和去氧的動力學行為，評價其攜氧功能具有重要的臨床應用意義。 作為一種無損

3、、快速而靈敏的光譜學檢測方法，拉曼光譜技術在生物醫(yī)學領域的應用日漸廣泛。由于水的拉曼散射非常微弱，因此該技術適合于水溶液環(huán)境中的生物大分子、細胞等的研究。激光鑷子和顯微拉曼光譜相結(jié)合的光鑷拉曼光譜（Laser tweezers Ramanspectroscopy，LTRS）技術，利用光鑷俘獲和囚禁細胞，可消除普通顯微拉曼光譜技術將細胞固定在玻片上所引起的不良影響，并獲得信噪比更高的光譜。LTRS技術在單個功能紅細胞的研究中已表現(xiàn)其獨特的

4、優(yōu)勢。有望實現(xiàn)地貧的診斷和攜氧功能的研究。但系統(tǒng)噪聲和熒光效應等引起的高強度的光譜背景，將降低譜線強度與背景的比值，以至于嚴重影響了基于光譜強度的分析結(jié)果。因此進行光譜數(shù)據(jù)有效處理是必要的。 本文應用LTRS系統(tǒng)收集正常對照、中間型α-地貧（HbH、HbH-CS）和重型β-地貧的紅細胞的拉曼光譜，采用最小二乘多項式曲線擬合進行光譜背景（也稱基線）校正，聚類分析、主成分分析、神經(jīng)網(wǎng)絡等用于光譜數(shù)據(jù)壓縮或模式識別，實現(xiàn)不同地貧類型的

5、判別。 此外，分析單細胞的氧合及去氧動力學過程及細胞差異性。主要開展了以下四個研究工作： （1）針對系統(tǒng)噪聲和熒光效應等引起高強度光譜背景影響基于光譜強度的統(tǒng)計分析結(jié)果的問題，利用最小二乘多項式進行光譜背景的擬合并去除背景。通過對比不同的數(shù)據(jù)處理方法聚類分析結(jié)果，表明最小二乘多項式曲線擬合進行光譜基線校正可顯著提高地貧紅細胞與正常人紅細胞的識別度。其中，α-地貧HbH組與正常對照組間的平均區(qū)分度為90.32％，α-地貧H

6、bH-CS組與正常對照組間的區(qū)分度97.6％，遠高于其他處理方法的結(jié)果。而且，該方法對實驗系統(tǒng)穩(wěn)定性要求不高。 （2）將主成分分析（PCA）算法和BP網(wǎng)絡預測模型相結(jié)合，進行地貧紅細胞類型的判別。PCA 結(jié)果顯示，正常對照與α-地貧HbH-CS基本可區(qū)分，但正常對照與重型β-地貧、α-地貧HbH-CS 與重型β-地貧間差異不明顯。將歸一化處理的前五個主成分進行BP網(wǎng)絡訓練及預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照與α-地貧HbH-CS 間預測正

7、確率高達97.90％，正常對照與重型β-地貧、α-地貧HbH-CS 與重型β-地貧間預測正確率分別為90.72％和86.28％。該結(jié)果與平均拉曼光譜及主成分分析結(jié)果基本吻合。取不同的實驗條件下收集的光譜進行同樣的分析，三種組合的預測正確率略有不同，分別為95.28％，92.08％，91.85％，但呈現(xiàn)基本相同的規(guī)律。 （3）激光鑷子共焦顯微拉曼光譜與氣體控制裝置相結(jié)合，窺視紅細胞的攜氧能力。分析激光功率對氧合狀態(tài)分析的影響，氧合

8、態(tài)和去氧態(tài)的對比及區(qū)分指標的選擇，并運用該指標分析了不同保存時間、不同健康狀態(tài)紅細胞的攜氧能力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，較強功率的激光照射細胞會導致其亞鐵血紅素聚合特征峰1248 cm-1、1371 cm-1升高； I1638/I1547 是區(qū)分氧合態(tài)與去氧態(tài)的良好標志；經(jīng)較長時間保存的紅細胞氧合能力增強，但去氧能力沒有發(fā)生顯著性變化；α-地貧HbH-CS 紅細胞氧合能力比正常對照的強，但其去氧能力較差。 （4）應用光鑷拉曼光譜系統(tǒng)監(jiān)

9、測地貧和正常對照單個紅細胞氧循環(huán)過程光譜的變化。在單細胞的水平上研究α-地貧HbH-CS和正常對照功能紅細胞氧合及去氧能力。比較分析α-地貧HbH-CS和健康個體單個紅細胞的氧循環(huán)過程的氧合及去氧能力及去氧態(tài)群體紅細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在氧循環(huán)的去氧態(tài)中，α-地貧HbH-CS的I1638/I1547 顯著高于正常對照；氧合態(tài)其I1638/I1547 也略高于正常對照。群體統(tǒng)計中，若以小于正常對照I1638/I1547的平均值為去氧態(tài)基準，則正