嗅鞘細(xì)胞與睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在視神經(jīng)損傷治療中的協(xié)同作用.pdf

1、[目的] 視神經(jīng)損傷后難以再生,至今尚未找到促進(jìn)損傷視神經(jīng)完全修復(fù)的方法。近來研究證明,嗅鞘細(xì)胞及睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子均可有效促進(jìn)損傷神經(jīng)修復(fù)再生。本研究首次將尚處于實(shí)驗(yàn)階段的嗅鞘細(xì)胞移植術(shù)和已進(jìn)入臨床應(yīng)用的睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)玻璃體內(nèi)注射聯(lián)合應(yīng)用,以期達(dá)到更理想的治療視神經(jīng)損傷的效果,為臨床救治視神經(jīng)乃至中樞神經(jīng)損傷提供新思路及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 [方法] 本研究應(yīng)用該校神經(jīng)生物學(xué)教研室的OECs原代培養(yǎng)技術(shù),體外培養(yǎng)純化OECs

2、。然后建立成年SD大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型：本實(shí)驗(yàn)采取經(jīng)眶上緣暴露視神經(jīng)的方法制作視神經(jīng)吸斷傷模型,將體外培養(yǎng)純化的OECs植入球后視神經(jīng)鞘膜下視神經(jīng)軸突的吸斷處,同時(shí)玻璃體內(nèi)注射CNTF。按治療手段不同,將實(shí)驗(yàn)大鼠分為對(duì)照組、CNTF組、OECs組和OECs+CNTF聯(lián)合應(yīng)用組。術(shù)后4w,采用霍亂毒素B亞單位(CTB)順行示蹤技術(shù)及熒光金(FG)、生物素化葡聚糖胺(BDA)逆行示蹤技術(shù)評(píng)價(jià)OECs和CNTF對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活和視神經(jīng)軸

3、突再生的影響。通過計(jì)算視網(wǎng)膜上相同視野下視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞即神經(jīng)元的存活數(shù)、神經(jīng)元的突起長(zhǎng)度和密度進(jìn)行方差分析和多元線性回歸分析,評(píng)價(jià)OECs和CNTF對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突的逆行性保護(hù)作用,比較OEgs、CNTF單獨(dú)應(yīng)用及聯(lián)合應(yīng)用對(duì)損傷視神經(jīng)修復(fù)再生的影響,驗(yàn)證二者的協(xié)同作用。 [結(jié)果] 一、成功進(jìn)行OECs體外原代培養(yǎng)和純化 應(yīng)用原代培養(yǎng)技術(shù),并用差速貼壁、阿糖胞苷抑制和Forskolin.SPE營(yíng)養(yǎng)物處理

4、,從2.5月成年大鼠的嗅球分離、培養(yǎng)和純化OECs。根據(jù)p75 NGFR免疫細(xì)胞熒光染色及Hoechst細(xì)胞核標(biāo)記染色分析了所得細(xì)胞的純度并對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)胞活性進(jìn)行比較。成年大鼠來源的OECs純化周期為10d,所得純度可達(dá)95％以上,純化后12-14d左右細(xì)胞活力開始下降。成年大鼠來源的OECs所得純度較高,有利于進(jìn)一步研究。 二、OECs和CNTF對(duì)大鼠視神經(jīng)損傷后神經(jīng)元的保護(hù)作用 建立成年SD大鼠視神經(jīng)吸斷傷模型

5、,將體外培養(yǎng)純化的OECs植入視神經(jīng)吸斷處鞘膜下,同時(shí)玻璃體注射CNTF。按治療手段不同,將實(shí)驗(yàn)大鼠分為對(duì)照組、CNTF組、OECs組和OECs+CNTF聯(lián)合應(yīng)用組。4w后,通過計(jì)算視網(wǎng)膜上相應(yīng)象限視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞即神經(jīng)元的存活數(shù)、神經(jīng)元的突起長(zhǎng)度和密度進(jìn)行方差分析和線性回歸分析,評(píng)價(jià)OECs和CNTF對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞及其軸突的逆行性保護(hù)作用。與正常眼大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞數(shù)量相比,對(duì)照組損傷眼神經(jīng)元明顯減少。各治療組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存

6、活數(shù)明顯多于對(duì)照組,且神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度及密度也均大于對(duì)照組。OECs組的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活數(shù)高于CNTF組,證明OECs保護(hù)視神經(jīng)元作用強(qiáng)于CNTF。 三、OECs和CNTF在視神經(jīng)損傷修復(fù)過程中具有協(xié)同作用 在觀測(cè)、統(tǒng)計(jì)上述各視神經(jīng)損傷指標(biāo)時(shí)發(fā)現(xiàn),與CNTF或OECs單用組相比,CNTF和OECs聯(lián)合應(yīng)用組對(duì)視神經(jīng)損傷的修復(fù)作用最強(qiáng)。提示CNTF和IOECs在視神經(jīng)損傷修復(fù)治療中具有協(xié)同作用。 [結(jié)論]局部應(yīng)用