黃瓜幾種主要病害的ELISA檢測(cè)研究.pdf

1、黃瓜角斑病、黑星病、炭疽病是我國(guó)黃瓜生產(chǎn)上重要病害，各地發(fā)生普遍，常年為害，嚴(yán)重影響蔬菜生產(chǎn)安全。黃瓜紅粉病、褐斑病是近年來(lái)北方地區(qū)新發(fā)生病害，蔓延加劇的趨勢(shì)明顯。病害診斷是病害防治的關(guān)鍵，常規(guī)診斷方法存在經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)、時(shí)有誤診發(fā)生的特點(diǎn)。有鑒于此，本研究目的在于建立了一套快速、準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)方法，用于黃瓜角斑病、黑星病、炭疽病、紅粉病和褐斑病的診斷，為病害防治提供依據(jù)。 經(jīng)過(guò)對(duì)ELISA檢測(cè)黃瓜病害方法的研究與驗(yàn)證，確定了病原真

2、菌和細(xì)菌的抗原制備方法，分析了2種抗血清純化方法的特點(diǎn)和效果，確立了ELISA檢測(cè)病害的質(zhì)量控制參數(shù)，證實(shí)了ELISA用于病害診斷的可行性，為農(nóng)業(yè)病害診斷試劑盒的推廣應(yīng)用提供參考。 利用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)病原真菌(黃瓜黑星病菌、炭疽病菌、紅粉病菌、褐斑病菌)，解決了一些病菌在固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生菌絲量少的困擾，為大規(guī)模提取菌絲蛋白作抗原建立了可行的模式；采用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)黃瓜角斑病菌，滅活后離心洗滌制備菌體抗原。該法制備抗原較提取病菌某

3、一組分作抗原簡(jiǎn)單，成本低，而且免疫效果能滿(mǎn)足病害檢測(cè)要求，抗血清終點(diǎn)效價(jià)都超過(guò)20,000。 選取報(bào)道的4種常用包被液分別包被抗原進(jìn)入ELISA程序，研究了各種包被液對(duì)檢測(cè)效果的影響。證實(shí)以0.05mol/L、pH9.6的碳酸鹽緩沖液包被抗原效果最好，對(duì)大多數(shù)試劑盒適用。 比較了硫酸銨分步鹽析和冷乙醇沉淀2種抗體純化方法，證實(shí)硫酸銨鹽析在純化IgG抗體上的優(yōu)勢(shì)。利用改良過(guò)碘酸鈉法對(duì)初步純化抗體進(jìn)行HRP標(biāo)記，結(jié)果表明該法

4、可行，省略了通行的抗血清鹽析和標(biāo)記后進(jìn)一步純化的步驟，但對(duì)效果會(huì)有一定影響。 方陣滴定確定了各種病菌所對(duì)應(yīng)抗體最適工作濃度，抗體工作濃度在1～20μg/mL之間。 模擬田間檢測(cè)，表明研制的ELISA試劑盒檢測(cè)靈敏度在ng水平(菌絲蛋白)，分別為黑星病菌小于500ng/mL、炭疽病菌50ng/mL、紅粉病菌250ng/mL、褐斑病菌50ng/mL，對(duì)角斑病菌的檢測(cè)靈敏度為4×104CFU/mL；準(zhǔn)確性好，模擬田間檢測(cè)準(zhǔn)確率