紫外線白內(nèi)障大鼠模型建立及二硫蘇糖醇的療效評估.pdf

1、白內(nèi)障目前是世界上影響人類健康的常見病，是我國的第一位致盲疾病，發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，它的發(fā)生與多種因素有關(guān)，是多種因素綜合作用的結(jié)果，比如晶狀體蛋白基因突變、氧化損傷、輻射、老化、葡萄糖、半乳糖等代謝障礙、脂質(zhì)過氧化物損傷等，發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)是晶狀體發(fā)生混濁，影響光線經(jīng)過晶狀體的透射和折射，從而造成視物不清。 紫外線(ultrayiolet，UV)是波長為100～400nm的電磁波。它又分為：近紫外線UV-A(315～380nm

2、)、遠(yuǎn)紫外線UV-B(290nm～315nm)和超短紫外線UV-C((290nm)三部分。紫外線引起白內(nèi)障的現(xiàn)象已在許多流行病學(xué)調(diào)查和實驗研究中得到證實。研究表明，紫外線對晶狀體上皮細(xì)胞的損傷作用隨波長不同而不同，UV-A不能直接引起DNA的損傷，而UV-B作用較強。長期遭受慢性紫外線輻射，亦被認(rèn)為是老年性白內(nèi)障形成的重要因素。高原地區(qū)，尤其海拔最高的西藏高原由于空氣稀薄，對來自太陽的紫外線的濾過作用弱，所受紫外線照射強度約為內(nèi)地的2.

3、5倍；許多高原地區(qū)常年積雪，這也是反射紫外線的最強物質(zhì)，雪域高原的強紫外線照射與強反射共同作用，使高原地區(qū)人群眼病發(fā)病率明顯高于內(nèi)地。資料表明老年性白內(nèi)障發(fā)病率與海拔的增高成正比，如西藏地區(qū)白內(nèi)障的發(fā)病率與種族無關(guān)，而與海拔有關(guān)；日本對紫外線白內(nèi)障研究表明：UV-B引起晶狀體皮質(zhì)及核混濁，相對年輕女性晶狀體核混濁比皮質(zhì)混濁顯著。但有研究顯示皮質(zhì)及后囊下白內(nèi)障與紫外線輻射量有關(guān)，核性白內(nèi)障與其無關(guān)。 眾所周知，臭氧層是UV-B輻射

4、的主要屏障，由于臭氧層的減少和紫外線輻射的增加，導(dǎo)致白內(nèi)障更高的發(fā)病率。資料顯示臭氧層減少1％的厚度，白內(nèi)障的發(fā)生率將增加0.7％±0.1％；美國一項研究表明臭氧層減少1％的厚度，白內(nèi)障的發(fā)生率將增加7％～10％，到2050年隨著5～20％臭氧層的破壞，美國出現(xiàn)皮質(zhì)性白內(nèi)障患者將增加到16.7～83萬例。紫外線對晶狀體的影響是長期、慢性蓄積的氧化損傷過程。 本課題組前期研究成果表明二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT

5、)具有良好的抗晶狀體蛋白變性的作用，DTT是化學(xué)還原劑，可解開蛋白分子內(nèi)及蛋白分子間的二硫鍵，并作為巰基保護(hù)劑，能抑制晶狀體蛋白的熱變性及非特異性聚集及熱變性。前期研究已證明該藥物在第8天用藥后使硒性核性白內(nèi)障核區(qū)斑塊明顯小于對照組。 既然前期試驗結(jié)果表明DTT硒性白內(nèi)障晶狀體混濁有明顯的抑制作用，那么對于紫外線引起的白內(nèi)障是否也有效果呢，本實驗將對DTT對紫外線白內(nèi)障的療效做初步評價，并對紫外線白內(nèi)障的發(fā)病機(jī)理進(jìn)行探討。這些研

6、究的基礎(chǔ)需要建立紫外線白內(nèi)障的動物模型，基于此，需要建立快速、穩(wěn)定的紫外線白內(nèi)障大鼠模型。 目前常用的構(gòu)建紫外線白內(nèi)障模型的方法主要是采用豚鼠，且造模周期長，不適合快速造模、觀察晶狀體混濁變化以及篩選干預(yù)藥物所需。本文改良紫外誘導(dǎo)SD大鼠造模方法，應(yīng)對快速造模需要。國外關(guān)于紫外線白內(nèi)障造模的研究較多，但多為探討輻射對指標(biāo)造模結(jié)果的影響而非加快造模方法。因此本課題將細(xì)致研究紫外線白內(nèi)障模型的建立，探索造模優(yōu)化條件，盡量縮短造模時間

7、，為后續(xù)研究提供便利，并以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步研究課題組前期藥物DTT對紫外線白內(nèi)障的療效。 研究目的： 探討紫外線輻射致SD大鼠白內(nèi)障的實驗方法，優(yōu)化實驗條件，初步研究紫外線致白內(nèi)障的機(jī)理及自行配制的二硫蘇糖醇(DTT)滴眼液對于SD大鼠紫外線白內(nèi)障的抑制作用。 主要方法： 1．紫外線白內(nèi)障大鼠模型的建立 SD大鼠，6W齡，置于300nmUVB輻射，每天用裂隙燈顯微鏡觀察大鼠晶狀體的形態(tài)變化，對照

8、紫外線白內(nèi)障分級標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分級。至造模成功白內(nèi)障形成后，取出晶狀體離體培養(yǎng)，用暗視野電子顯微鏡觀察晶狀體的結(jié)果，經(jīng)過處理后用透射及掃描電子顯微鏡觀察晶狀體的超微結(jié)構(gòu)。 2．紫外線致白內(nèi)障機(jī)理研究 剝離造模成功的大鼠眼晶狀體和空白對照組大鼠眼晶狀體，用過氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione hormone，GSH)試劑盒測定兩組鼠眼晶狀體中S

9、OD和GSH含量，并取血送檢血清生化指標(biāo)，可以反映出輻射紫外線和正常對照組中酶含量及血清離子的變化。 3．DTT的療效評估 紫外輻射造模，SD大鼠左眼均作為實驗用藥組，滴用我室自制的二硫蘇糖醇(DTT)眼液；同鼠右眼作對照。在造模過程中，左眼每天滴用DTT眼液4次，每次1滴，實驗過程中保持用藥。右眼僅輻射紫外線但不用藥。定期觀察大鼠雙眼白內(nèi)障的發(fā)生發(fā)展過程，至紫外線白內(nèi)障模型建立成功后，裂隙燈觀察對比雙眼晶狀體的形態(tài)變化

10、，而后取出晶狀體做免疫組化，經(jīng)過處理后用掃描電子顯微鏡觀察晶狀體的超微結(jié)果，并測定兩組晶狀體中SOD、GSH含量進(jìn)行對比。 實驗結(jié)果： 1．將出生后6W的雄性SD大鼠腹腔注射10％水合氯醛0.7ml，置于300nm紫外線燈下輻射15min，(雙星明眼液和新福林眼液擴(kuò)瞳后，每日輻射雙眼一次)，輻照度1×103uw/cm2，2天后即有少數(shù)大鼠發(fā)生輕度晶狀體混濁，7天后可成功制作紫外線白內(nèi)障動物模型，絕大多數(shù)白內(nèi)障為皮質(zhì)性白內(nèi)

11、障。 2．輻射紫外線致白內(nèi)障組鼠眼晶狀體中SOD、GSH含量明顯比空白對照組低；血清生化指標(biāo)Ca2+、Na+高于空白對照組，K、P、Mg2+低于空白對照組。 3．紫外線輻射2天實驗大鼠右眼即可發(fā)生輕度晶狀體混濁，7天造模成功，右眼幾乎100％發(fā)生皮質(zhì)性白內(nèi)障，可以觀察到晶狀體體積增大，皮質(zhì)明顯混濁，少數(shù)核輕度混濁，相對清澈。左眼DTT藥物組白內(nèi)障皮質(zhì)混濁程度明顯比右眼對照組減輕，參考文獻(xiàn)分級標(biāo)準(zhǔn)，右眼對照組均在2級左右，