鈣衛(wèi)蛋白在妊娠期高血壓疾病中的表達及其發(fā)病機制的研究.pdf

1、目的：妊娠期高血壓疾病是產(chǎn)科最常見的合并癥，在我國發(fā)病率為9.40％，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍生兒病率及死亡率升高的主要原因。子癇前期和子癇是妊娠期高血壓疾病的嚴重階段，至今病因和發(fā)病機理不明，給預(yù)防和治療帶來困難。近年來，國內(nèi)國外的專家學(xué)者對其病因和發(fā)病機理作了大量的研究工作，提出了許多學(xué)說，目前比較公認的發(fā)病機制是免疫學(xué)說、胎盤或滋養(yǎng)葉細胞缺血學(xué)說、遺傳學(xué)說、血管活性物質(zhì)學(xué)說、鈣平衡失調(diào)學(xué)說、血管內(nèi)皮損傷學(xué)說，但仍無一種理論能滿意、全面地解

2、釋其病因?，F(xiàn)又有學(xué)者提出了一種新的理論，炎癥刺激可能參與了妊娠期高血壓疾病的發(fā)病過程，并且已有學(xué)者用內(nèi)毒素刺激成功地建立了子癇前期的動物模型，且抗炎治療有效。說明感染可導(dǎo)致母胎免疫平衡失調(diào)，引起免疫損傷，滋養(yǎng)細胞缺血及胎盤植入異常，加重胎盤缺血缺氧，血漿毒性因子釋放，引起全身的血管內(nèi)皮損傷，最終導(dǎo)致子癇前期和子癇。
　　 胎盤是一個重要的免疫器官，內(nèi)含大量單核巨噬細胞，被認為是子癇前期患者體內(nèi)“毒性因子”的來源，胎盤滋養(yǎng)細胞的作

3、用頗受關(guān)注。有學(xué)者認為妊娠期滋養(yǎng)細胞也是一種免疫細胞，是天然免疫系統(tǒng)的組成部分，影響母兒的免疫應(yīng)答。滋養(yǎng)細胞和巨噬細胞具有某些共同特性：吞噬、形成合體細胞、組織浸潤功能；表達CD4、CD14、IgG受體；分泌白介素-1、2和6(IL-1，IL-2，IL-6)，干擾素-γ(INF-γ)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等多種細胞因子，并表達它們的受體。許多學(xué)者的關(guān)注。鈣衛(wèi)蛋白是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新的與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)的鈣結(jié)合蛋白，屬于S100

4、蛋白家族的成員，是由S100A8和S100A9構(gòu)成的異二聚體，主要表達于中性粒細胞、單核-巨噬細胞，具有抑制細胞增殖、誘導(dǎo)細胞凋亡、調(diào)節(jié)免疫、參與炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)功能，在許多急慢性炎癥疾病中發(fā)現(xiàn)其表達升高，有提出鈣衛(wèi)蛋白可以在一定程度上反映炎癥疾病的嚴重程度。糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)是鈣衛(wèi)蛋白的受體，可與鈣衛(wèi)蛋白結(jié)合后啟動若干信號通路，介導(dǎo)多種炎癥病理過程。TNF-α是一種促炎性細胞因子，在妊娠組織中通過自分泌或旁分泌作用調(diào)節(jié)

5、局部的子宮活動，從而參與許多生理和病理過程。
　　 目前，鈣衛(wèi)蛋白在子癇前期母血中的表達國外僅有少量報道，國內(nèi)尚無報道。在母血、胎盤、滋養(yǎng)細胞中的研究國內(nèi)外至今無報道。為探討鈣衛(wèi)蛋白對滋養(yǎng)細胞的致炎作用及妊娠期高血壓疾病的發(fā)病機制，擬檢測鈣衛(wèi)蛋白及其受體RAGE和TNF-α在妊娠期高血壓疾病中的表達，研究鈣衛(wèi)蛋白對滋養(yǎng)細胞表達炎性介質(zhì)的誘導(dǎo)作用及NF-κB、p38 MAPK、ERK信號傳導(dǎo)通路對其的調(diào)控作用。以尋找一種藥物能夠抑

6、制鈣衛(wèi)蛋白的上調(diào)，進而抑制炎性介質(zhì)的釋放，及是否需聯(lián)合應(yīng)用抗生素來治療妊娠期高血壓疾病開辟一條新路。
　　 研究方法
　　 一、鈣衛(wèi)蛋白及其受體RAGE和TNF-α在妊娠期高血壓疾病中的表達
　　 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法檢測妊娠期高血壓疾病患者胎盤組織中鈣衛(wèi)蛋白、RAGE和TNF-α的表達，采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法，檢測妊娠期高血壓疾病患者血清中鈣衛(wèi)蛋白和TNF-α的表達

7、。
　　 二、鈣衛(wèi)蛋白對人滋養(yǎng)細胞表達TNF-α的誘導(dǎo)作用
　　 采用人鈣衛(wèi)蛋白作用于原代培養(yǎng)的早孕期細胞滋養(yǎng)細胞，以MTT法檢測鈣衛(wèi)蛋白對滋養(yǎng)細胞的增殖活性的影響，透射電鏡下觀察鈣衛(wèi)蛋白作用后滋養(yǎng)細胞超微結(jié)構(gòu)的改變，以ELISA法、Real Time PCR法檢測鈣衛(wèi)蛋白對滋養(yǎng)細胞釋放TNF-α在不同的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)下的影響。
　　 三、鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細胞表達TNT-α的細胞信號傳導(dǎo)通路探討
　　

8、 體外培養(yǎng)的人原代滋養(yǎng)細胞分別與ERK抑制劑PD98059、p38MAPK抑制劑SB203580和NF-κB抑制劑BAYl1-7082，以及PD98059聯(lián)合SB203580共孵育2h后，培養(yǎng)基中分別加入重組人鈣衛(wèi)蛋白作用6h。采用ELISA法測定培養(yǎng)上清中TNF-α的含量，用Real Time PCR法檢測培養(yǎng)細胞中TNF-αmRNA表達。
　　 結(jié)果
　　 一、鈣衛(wèi)蛋白及其受體RAGE和TNF-α在妊娠期高血壓疾病

9、中的表達
　　 妊娠期高血壓疾病組血清鈣衛(wèi)蛋白和TNF-α水平明顯高于對照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；重度子癇前期患者較輕度子癇前期患者明顯升高(P＜0.01)，而輕度子癇前期患者明顯高于妊娠期高血壓患者(P＜0.05)，妊娠期高血壓患者高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 兩組孕婦絨毛間質(zhì)巨噬細胞和中性粒細胞中均有鈣衛(wèi)蛋白陽性表達，主要位于細胞膜及細胞質(zhì)中。妊娠期高血壓疾病組胎盤組

10、織中鈣衛(wèi)蛋白陽性表達率明顯高于對照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；輕、重度子癇前期患者明顯高于對照組(P＜0.05，P＜0.01)，且輕、重度子癇前期患者間相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；妊娠期高血壓患者與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。兩組孕婦胎盤絨毛合體滋養(yǎng)細胞及部分蛻膜細胞中均有RAGE、TNF-α陽性表達，位于主要在細胞膜和細胞質(zhì)。妊娠期高血壓疾病組胎盤組織中RAGE、TNF-α陽性表達率明

11、顯高于對照組，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)；妊娠期高血壓和輕、重度子癇前期患者呈逐漸升高趨勢，輕、重度間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 妊娠期高血壓疾病組血清鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.359，P＜0.05)；對照組血清鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平無相關(guān)性(r=0.184，P＞0.05)。妊娠期高血壓疾病組胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.383，P＜0.01)

12、；對照組胎盤組織鈣衛(wèi)蛋白水平與TNF-α水平無相關(guān)性(r=0.130，P＞0.05)。妊娠期高血壓疾病組及對照組血清鈣衛(wèi)蛋白表達與胎盤組織中鈣衛(wèi)蛋白的陽性表達均呈正相關(guān)性(r=0.365，P＜0.0l；r=0.675，P＜0.01)。
　　 二、鈣衛(wèi)蛋白對人滋養(yǎng)細胞表達TNF-α的誘導(dǎo)作用
　　 鈣衛(wèi)蛋白作用24小時后藥物濃度與細胞滋養(yǎng)細胞增殖活性呈負相關(guān)(r=-0.735，P＜0.01)，即隨著鈣衛(wèi)蛋白藥物濃度的增加，

13、細胞生長受到抑制。在800 ng/ml及其以上組表現(xiàn)更為明顯(P＜0.01)。但是，在小劑量藥物濃度(＜0.39ng/ml)刺激時，鈣衛(wèi)蛋白可刺激細胞滋養(yǎng)細胞的增殖，特別是在濃度0.20 ng/ml處更為明顯(P＜0.01)。作用時間為48小時，鈣衛(wèi)蛋白與細胞滋養(yǎng)細胞增殖活性的上述關(guān)系更為明顯。
　　 透射電鏡下可見，經(jīng)鈣衛(wèi)蛋白處理過的細胞滋養(yǎng)細胞的細胞核小，核膜模糊，核內(nèi)異染色質(zhì)邊集，呈半月狀，呈凋亡改變，胞質(zhì)內(nèi)線粒體多有嵴減

14、少，個別呈空泡樣變，胞膜多溶解。
　　 將人鈣衛(wèi)蛋白加入到原代培養(yǎng)的早孕期細胞滋養(yǎng)細胞培養(yǎng)液中能明顯刺激其TNF-α的分泌。在0～500ng/ml范圍內(nèi)，ELISA、Real Time PCR法檢測鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞的TNF-α分泌均增加，均呈明顯的劑量依賴性關(guān)系，在1000ng/ml鈣衛(wèi)蛋白對滋養(yǎng)細胞分泌TNF-α的誘導(dǎo)作用減弱。鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)滋養(yǎng)細胞的TNF-α分泌在3～48 h間均呈雙峰形，在6h和24h分泌TNF-α增強

15、。
　　 三、鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細胞表達TNF-α的細胞信號傳導(dǎo)通路探討
　　 ELISA法檢測鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細胞表達TNF-α增加，PD98059、SB203580及BAYll-7082均可顯著下調(diào)鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細胞產(chǎn)生TNF-α(P＜0.05)，同時使用PD98059和SB203580可增強抑制TNF-α的分泌水平(P＜0.05)。
　　 Real Time PCR法檢測鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細胞表達TN

16、F-α mRNA增加，PD98059、SB203580或BAYll-7082均可顯著下調(diào)鈣衛(wèi)蛋白誘導(dǎo)人滋養(yǎng)細胞表達TNF-αmRNA(P＜0.05)，PD98059和SB203580具有協(xié)同抑制作用(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、鈣衛(wèi)蛋白、RAGE、TNF-α蛋白在妊娠期高血壓疾病病情加重進展中表達逐漸上調(diào)，有望成為子癇前期嚴重程度評估、疾病預(yù)測和判斷預(yù)后的有效指標。
　　 2、高濃度的鈣衛(wèi)蛋白對體外