轉(zhuǎn)錄因子AtMYB73調(diào)控?cái)M南芥抗Pst DC3000和灰葡萄孢的機(jī)制分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室前期明確了AtMYB73基因在擬南芥抵抗核盤菌侵染過程中具有重要作用，并確定了AtMYB73通過影響水楊酸(SA)信號途徑和茉莉酸(JA)信號途徑抵抗核盤菌的侵染。本研究旨在明確AtMYB73基因在調(diào)控?cái)M南芥抵抗丁香假單胞桿菌番茄致病變種(Pseudomonas syringae pv tomato DC3000，Pst DC3000)與灰葡萄孢（Botrytis cinerea，B.cinerea）過程中的作用，確定AtMYB

2、73基因與SA和JA抗病信號途徑及信號途徑關(guān)鍵基因之間的調(diào)控關(guān)系，為進(jìn)一步闡明AtMYB73基因調(diào)控?cái)M南芥抗病的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。主要結(jié)果如下:
　　1.對AtMYB73基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)AtMYB73蛋白為親水性蛋白，不存在跨膜結(jié)構(gòu)域，AtMYB73蛋白有26個磷酸化位點(diǎn)，預(yù)測AtMYB73基因可能是通過可逆的磷酸化反應(yīng)對逆境脅迫進(jìn)行感知和應(yīng)答的。
　　2.利用RT-PCR技術(shù)分析了不同周齡野生型擬南芥中AtM

3、YB73基因的表達(dá)規(guī)律，確定了AtMYB73基因的表達(dá)水平隨著植株的生長發(fā)育呈上升趨勢。
　　3.檢測了4種AtMYB73基因不同T-DNA插入位點(diǎn)的突變體對Pst DC3000的敏感性，發(fā)現(xiàn)4株myb73突變體的感病癥狀均較野生型更為明顯;接種后myb73突變體中病菌的cfu值均明顯高于野生型，胼胝質(zhì)的含量均明顯少于野生型，說明myb73突變體對Pst DC3000的敏感性增強(qiáng)，表明AtMYB73為擬南芥抗Pst DC3000的

4、正調(diào)控因子。
　　4.將擬南芥野生型Col-0和4種myb73突變體分別接種灰葡萄孢，檢測myb73突變體對灰葡萄孢的抗病性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4株myb73突變體的感病癥狀較野生型明顯減輕，接種的myb73突變體中BcACTIN基因的表達(dá)水平明顯低于野生型，接種的myb73突變體葉片中壞死細(xì)胞的面積明顯小于野生型，接種后myb73突變體的葉綠素含量均明顯高于野生型，且接種后myb73突變體的葉片死亡率均明顯低于野生型，說明myb73突變

5、體對灰葡萄孢的抗性較野生型明顯增強(qiáng)，表明AtMYB73為擬南芥抗灰葡萄孢的負(fù)調(diào)控因子。
　　5.接種Pst DC3000后myb73突變體中抗病相關(guān)基因PR1、NPR1、JAR1和PDF1.2的表達(dá)水平均明顯低于野生型水平，且myb73突變體中NPR1基因的表達(dá)水平在接種后不同時(shí)間沒有明顯的變化;接種灰葡萄孢后，myb73突變體中SA途徑關(guān)鍵基因PR1和NPR1的表達(dá)水平明顯低于野生型，而JA途徑關(guān)鍵基因PDF1.2和JAR1的表

6、達(dá)水平明顯高于野生型。表明AtMYB73基因通過正調(diào)控SA和JA信號途徑影響擬南芥對Pst DC3000的抗性，通過正調(diào)控SA信號途徑、負(fù)調(diào)控JA信號途徑影響擬南芥對灰葡萄孢的抗性。
　　6.將Pst DC3000接種于myb73、npr1和myb73/npr1突變體后發(fā)現(xiàn)，myb73/npr1突變體的感病癥狀較野生型和突變體myb73、npr1更為敏感，接種葉片中病原菌的cfu值明顯高于野生型和突變體myb73、npr1，接種后

7、myb73/npr1突變體中ICS1基因的表達(dá)量均低于野生型和突變體myb73、npr1，表明AtMYB73基因與NPR1基因處于不同的信號通路，共同調(diào)控SA途徑關(guān)鍵基因PR1和ICS1的表達(dá)。
　　7.將灰葡萄孢接種于myb73、jar1和myb73/jar1突變體后發(fā)現(xiàn)，myb73/jar1突變體的感病癥狀較野生型和jar1突變體的明顯減弱，而較突變體myb73感病癥狀更為明顯，接種后myb73/jar1突變體中BcACTIN

8、基因的表達(dá)水平、壞死細(xì)胞的面積、葉綠素含量及葉片死亡率的數(shù)據(jù)均與癥狀一致，接種后myb73/far1突變體中PDF1.2的表達(dá)水平要高于jar1突變體但低于myb73突變體，表明AtMYB73基因與JAR1基因處于不同的信號通路，共同調(diào)控JA途徑關(guān)鍵基因PDF1.2的表達(dá)。
　　8.試驗(yàn)成功構(gòu)建了AtMYB73基因的原核表達(dá)載體GST-AtMYB73，將其轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株BL21中進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，確定了AtMYB73蛋白原核表達(dá)

9、的最佳條件為IPTG0.1mmol/L，誘導(dǎo)溫度為28℃。通過GST親和純化方法，獲得了純化的GST-AtMYB73蛋白。
　　9.試驗(yàn)成功構(gòu)建了AtMYB73基因及其互作蛋白基因WRKY38、WRKY70、AT5G10430、AT4G23680、AT3G54890、和AT5G48180的酵母雙雜交載體AD-AtMYB73、BD-AtMYB73、AD-WRKY38、AD-WRKY70、BD-AT5G10430、BD-AT4G236