RGD靶向微泡與載藥微球在肝臟創(chuàng)傷滲血診斷和治療中的研究.pdf

1、第一部分靶向造影微泡制備及其在肝臟創(chuàng)傷滲血診斷中的研究
　　目的：制備三種超聲造影劑:普通脂質(zhì)微泡(MBMal)、靶向脂質(zhì)微泡(MBRGD)和對照脂質(zhì)微泡(MBRAD)，分別對其性質(zhì)進(jìn)行檢測，并通過動物實驗研究MBRGD在肝臟創(chuàng)傷滲血診斷中的價值。
　　方法：
　　(1)采用機(jī)械震蕩法制備各型MB，對其進(jìn)行形態(tài)、分散性、粒徑、電位、計數(shù)、多肽連接率、多膚連接量的觀察和測定;
　　(2)對各型MB進(jìn)行體內(nèi)外增強(qiáng)顯影

2、;
　　(3)各型MB體外尋靶能力的觀察;
　　(4)對12只新西蘭兔分成兩組進(jìn)行肝臟創(chuàng)傷造模，造模后兩組均首先靜脈注射MBMal，超聲造影(CEUS)觀察10min，證明無活動性出血但實際未完全止血情況下，實驗組注射MBRGD，對照組注射MBRAD，觀察病灶區(qū)域造影劑灌注狀況，共計10 min，脫機(jī)分析數(shù)據(jù)，每隔1min應(yīng)用DFY軟件測量感興趣區(qū)的平均灰度值(AGVs)，分別與其之前的MBMal造影圖像作對比分析。

3、　　結(jié)果：
　　(1)三種MB光鏡下觀察大小基本一致，分布均勻，分散性較好;MBMal、MBRGD及MBRAD的平均粒徑分別為:4.25±0.67μm，3.71±0.58μ m，4.18±0.86μ m;平均電位分別為:0.01±7.86mV，-37.3±3.44mV，-34.5±5.21mV;濃度分別是:2.52±0.26×108個/mL，2.74±0.12×108個/mL，2.34±0.46×108個/mL;MBRGD多肽結(jié)合

4、率為98.62％，MBRAD的多肽結(jié)合率為98.94％;多肽連接量分別是9.76±0.91×104個RGD/MBRGD，10.13±0.34×104個RAD/MBRAD。
　　(2)三種MB均在105數(shù)量級濃度時，增強(qiáng)顯影效果最佳，相同數(shù)量級濃度條件下三種MB的AGVs統(tǒng)計無明顯差異。體內(nèi)增強(qiáng)顯影開始于注射后10s左右，持續(xù)時間均在10min左右，三種MB在相同時間點(diǎn)的平均灰度值均無明顯差異。
　　(3)鏡下觀察MBRGD明

5、顯聚集于活化凝集的血小板周圍或內(nèi)部;MBMal與MBRGD與活化的血小板無明顯團(tuán)聚或粘附現(xiàn)象。(4)每組中均有5只動物模型制作成功。實驗組CEUS顯示MBRGD在創(chuàng)傷區(qū)域聚集，而對照組未見MBRAD聚集顯影。實驗組MBRGD較之于空白微泡MBMal在CEUS早期即1～3 min的表現(xiàn)相似，創(chuàng)傷灶的AGVs相比無統(tǒng)計學(xué)意義，P1min、P2min、P3min均大于0.05;自第4min開始，MBRGD開始在創(chuàng)傷灶內(nèi)有少量聚集，至第6min

6、，MBRGD進(jìn)行CEUS的AGVs較之于MBMal均有統(tǒng)計學(xué)意義，P4min、P5min＜0.01，P6min＜0.05;第7min時兩者的AGVs比較無統(tǒng)計學(xué)意義，Pmin＞0.05;第8、9min時MBRGD的AGVs較前降低，但較之于MBMal仍有統(tǒng)計學(xué)意義，P8min＜0.05，P9min＜0.05;至第10min時，兩者的AGVs比較無統(tǒng)計學(xué)差異，P10min＞0.05。對照組MBRAD較之于空白微泡MBMal在各個時間點(diǎn)的A

7、GVs比較均無統(tǒng)計學(xué)差異，P值均大于0.05。靶向微泡MBRGD與陰性對照微泡MBRAD進(jìn)行CEUS的AGVs在各個時間點(diǎn)相比，第4、10mm比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，P4min＞0.05，P10min＞0.05;其余時間點(diǎn)比較則均有統(tǒng)計學(xué)意義，其中，第2、3、6、8min比較差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義，P2min、P3min、P6min、P8min＜0.01;第1、5、7、9 min比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P1min、P5min、Pmin、P9m

8、in＜0.05。
　　結(jié)論：機(jī)械振蕩法制備RGD靶向脂質(zhì)微泡方法簡單，成泡率高，粒徑均一，分散度好，體外靶向性好，體內(nèi)外顯影效果好，對于滲血可以靶向顯影，可嘗試作為診斷肝臟創(chuàng)傷滲血的對比顯影劑，為臨床診斷提供新思路。
　　第二部分載氨甲環(huán)酸靶向微球的制備及其在肝臟創(chuàng)傷滲血治療中的研究
　　目的：制備四種高分子材料微球:載氨甲環(huán)酸靶向微球(PLGA-TXA-RGD)，載氨甲環(huán)酸空白微球(PLGA-TXA)，載氨甲環(huán)酸非靶

9、向微球(PLGA-TXA-RAD)，非載藥靶向微球(PLGA-RGD)，并對其性質(zhì)進(jìn)行檢測，通過動物實驗研究PLGA-TXA-RGD對肝臟創(chuàng)傷滲血的治療價值。
　　方法：
　　(1)采用雙乳化法制備各型PLGA微球，對其進(jìn)行形態(tài)、分散性、結(jié)構(gòu)、粒徑、電位、多肽連接率、載藥量、包封率及釋藥率進(jìn)行觀察及測定;
　　(2)48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為6組:生理鹽水組(N.S)，靜脈注射TXA組（I.V TXA），PLGA-TX

10、A-RGD組，PLGA-TXA組，PLGA-TXA-RGD組，PLGA-RGD組;肝臟創(chuàng)傷造模后經(jīng)尾靜脈緩慢注射各組試劑0.5 ml，自造模開始至滲血結(jié)束，記錄出血量、出血時間、干增重及3h內(nèi)死亡率，對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析；
　　(3)創(chuàng)傷灶處組織行冰凍切片處理，熒光顯微鏡下觀察創(chuàng)傷灶切口邊緣及血凝塊中PLGA微球的情況。
　　結(jié)果：
　　(1)光鏡下觀察各組PLGA微球粒徑較均勻，分散性好，無團(tuán)聚現(xiàn)象;透射電鏡觀察

11、到微球的結(jié)構(gòu)為球形，可見其殼樣結(jié)構(gòu)，欠光滑; PLGA-TXA-RGD，PLGA-TXA，PLGA-TXA-RAD，PLGA-RGD四種PLGA微球的平均粒徑分別是1811±369.4nm，1747±276.7nm，1831±268.3nm，1909±305.4 nm;平均電位分別是-24.7±4.4 mV，-24.3±4.49 mV，-24.6±3.61 mV，-25.5±4.28 mV;流式細(xì)胞儀檢測載藥PLGA微球連接RGD和RA

12、D多肽的連接率分別是92.88％和93.85％;載藥PLGA微球的包封率為18.5±2.4％，載藥量為3.7±0.5％。3h時超聲輻照組的釋藥率達(dá)到27.3±1.1％，非超聲輻照組的釋藥率達(dá)到20.0±1.6％。
　　(2)比較各組出血時間(t)、出血量(W)、出血量干增重(W')，P值均小于0.01，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。組間進(jìn)行兩兩比較，I.V TXA組與N.S組在t、W、W'上均有統(tǒng)計學(xué)差異，P值均小于0.05。對t進(jìn)行兩兩

13、比較時，PLGA-TXA-RGD組分別與I.V TXA組、PLGA-RGD組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，與PLGA-TXA-RAD組相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。對W進(jìn)行兩兩比較時，PLGA-TXA-RGD組與PLGA-RGD相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;與I.V TXA組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與PLGA-TXA、PLGA-TXA-RAD相比，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。對W'進(jìn)行兩兩比較時，比較結(jié)果同W組。比較各組死亡率，差異無統(tǒng)計學(xué)意義;兩兩比較，

14、差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　(3) PLGA-TXA組與PLGA-TXA-RAD組的創(chuàng)面邊緣未見大量的紅色熒光微球聚集成帶狀，僅在血凝塊內(nèi)部觀察到紅色熒光。PLGA-RGD組與PLGA-TXA-RGD組的創(chuàng)面邊緣可見橙紅色熒光微球聚集，數(shù)量較多，形成帶狀，在靠近創(chuàng)面邊緣形成血凝塊的部位可見紅色熒光微球聚集。
　　結(jié)論：雙乳化法制作的載氨甲環(huán)酸靶向PLGA微球粒徑均勻，分散性好，包封率及載藥量可，其具備靶向及載藥雙重功能，可作為止