二甲雙胍對高脂飼養(yǎng)大鼠肝臟AMPK和PPARs活性影響—改善脂肪肝的可能機制.pdf

1、在動物實驗探討脂毒性及NAFLD發(fā)生機制的基礎(chǔ)上，為了探討干預(yù)脂毒性和NAFLD的臨床對策，我們設(shè)計了一項歷時半年的臨床前瞻性研究，對NAFLD伴有以糖、脂代謝紊亂為主的代謝綜合征患者(非飲酒者)，在飲食調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)上，應(yīng)用AMPK激活劑二甲雙胍或PPARα激活劑非諾貝特干預(yù)，觀察二甲雙胍和非諾貝特對改善脂毒性和NAFLD的有效性和安全性。 目的： ①觀察長期高脂飼養(yǎng)對大鼠體重、血糖和胰島素水平的影響，及對血脂和肝臟脂質(zhì)含

2、量的影響，及二甲雙胍干預(yù)后上述指標的變化。 ②觀察長期高脂環(huán)境下，大鼠肝臟AMPKα、PPARα和PPARγ的活性及表達的改變。進一步觀察加用AMPKα激活劑二甲雙胍后，對高脂誘導(dǎo)的大鼠肝臟AMPKα、PPARα和PPARγ活性及表達變化的影響。探討肝臟AMPKα、PPARα和PPARγ在高脂誘導(dǎo)的脂毒性和肝臟脂肪變性中的作用，及二甲雙胍改善脂毒性和NAFLD的可能分子機制。 ③通過臨床前瞻性研究，觀察AMPKa激活劑二

3、甲雙胍和PPARa激活劑非諾貝特在調(diào)節(jié)糖、脂代謝紊亂的同時，對治療NAFLD的有效性和安全性。進一步驗證我們動物實驗的結(jié)果。 方法： ①大鼠分組及飼養(yǎng)：雄性Wistar大鼠30只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機分為2組：對照(Control)組(C組)10只，給予大鼠食用的標準飼料，其中碳水化合物熱卡占61％，脂肪熱卡占11％；高脂飼養(yǎng)組20只，給予高脂飲食，脂肪熱卡占59％，以飽和脂肪酸(豬大油)為主。高脂飼養(yǎng)組在4個月

4、后再隨機等分為2組：高脂(HF)組和高脂加二甲雙胍(HF+MET)組，各10只。HF組繼續(xù)高脂飼養(yǎng)。HF+MET組于高脂喂養(yǎng)第5個月開始，在高脂飼養(yǎng)的同時加用二甲雙胍(商品名：格華止)，劑量50mg·kg-1·d-1，每天早9點定時灌胃，持續(xù)1個月。 各組大鼠每日膳食熱量控制在310KJ/只，喂養(yǎng)期均為5個月。②機體水平脂毒性評價：喂養(yǎng)期間監(jiān)測大鼠體重和血糖水平；大鼠處死前，測體重、空腹血糖、空腹血胰島素和血脂水平；大鼠處死后，

5、測內(nèi)肝臟脂質(zhì)含量。 ③大鼠肝臟AMPKα、PPARα和PPARγ活性、基因和蛋白表達水平檢測：RT-Real time PCR檢測肝臟AMPKα1亞基、AMPKα2亞基和PPARα的mRNA水平；Western Blot檢測AMPKα亞基、磷酸化AMPKα亞基(P-AMPKα)和PPARα的蛋白水平；酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定PPARα、PPARγ,轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性。在此基礎(chǔ)上，觀察AMPK激活劑二甲雙胍對高脂誘導(dǎo)

6、的肝臟AMPK、PPARα和PPARγ,變化的影響，及對脂毒性和肝臟脂肪變性的改善作用。 ④臨床研究方法：對178例NAFLD伴有代謝綜合征的患者(非飲酒者)，分四組：飲食控制組(對照組，D組)、在對照組干預(yù)措施基礎(chǔ)上加用二甲雙胍組(A組)、在對照組干預(yù)措施基礎(chǔ)上加用非諾貝特組(B組)和不采取措施干預(yù)繼續(xù)原方式生活者(C組)。隨訪觀察半年，觀察治療前后體重(W)、體重指數(shù)(BMI)、腰圍(WC)、血壓(BP)空腹血糖(FPG)、

7、2小時血糖(2hPG)、空腹胰島素(FINS)、2hINS、穩(wěn)態(tài)模式胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)、血脂[包括：甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白(HDL)和低密度脂蛋白(LDL)]、肝功能、腎功能和血乳酸(Lactic acid，LA)的變化。糖代謝紊亂通過WHO推薦的75g口服葡萄糖耐量試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)評估。NAFLD的變化通過肝臟彩色超聲改變結(jié)合肝酶學(xué)的變化進

8、行評估(由同一指定的資深超聲診斷專家在同一臺彩色多普勒儀上，對比干預(yù)前后的肝臟彩色超聲圖象改變)。 結(jié)果： ①機體水平脂毒性的評價5個月后，HF組大鼠與對照組比較，體重、空腹血糖、空腹胰島素水平分別增高51.1％(P＜0.01)、21.5％(P＜0.05)和17％(P＜0.05)。與HF組相比，HF+MET組大鼠體重降低24.7％(P＜0.01)，空腹血糖和胰島素分別降低13％(P＜0.05)和10.8％(P＜0.05)

9、。提示在機體水平上提示高脂組大鼠發(fā)生胰島素抵抗和脂毒性，及二甲雙胍對高脂誘導(dǎo)的脂毒性的改善作用。 ②大鼠血清和肝組織中甘油三酯和膽固醇水平變化HF組大鼠與對照組比較，血清甘油三酯和膽固醇均顯著增高(P＜0.01)，肝細胞中甘油三酯和膽固醇含量均顯著增高(P＜0.05)；與HF組相比，加用二甲雙胍組大鼠血清和肝組織中甘油三酯和膽固醇均顯著降低(P＜0.05)。提示長期高脂環(huán)境可導(dǎo)致脂代謝紊亂和NAFLD，及二甲雙胍對高脂誘導(dǎo)的脂代

10、謝紊亂和NAFLD的改善作用。③大鼠肝臟磷酸化AMPKα(P-AMPKα)、PPARα和PPARγ活性變化以P-AMPKα的蛋白含量表示AMPKα的活性，與對照組相比，HF組P-AMPKα蛋白表達水平降低59％(P＜0.05)；與HF組相比，加用二甲雙胍組P-AMPKα蛋白表達水平增高89.1％(P＜0.05)。提示長期高脂喂養(yǎng)可顯著降低大鼠肝臟AMPKt活性，二甲雙胍可顯著改善高脂導(dǎo)致的其活性損害，證實二甲雙胍在肝臟具有激活A(yù)MPKα

11、作用。與對照組相比，高脂組大鼠肝臟PPARα和PPARγ轉(zhuǎn)錄因子活性水平分別降低21.6％(P＞0.05)和16.7％(P＞0.05)；加用二甲雙胍后高脂飼養(yǎng)大鼠肝臟PPARα和PPAARγ轉(zhuǎn)錄因子活性水平分別增高55％(P＜0.05)和5.7％(P＞0.05)，提示長期高脂環(huán)境可導(dǎo)致大鼠肝臟PPARα轉(zhuǎn)錄因子活性一定程度的降低，二甲雙胍可使PPARα轉(zhuǎn)錄因子活性顯著增強；而PPARγ轉(zhuǎn)錄因子活性的降低和增高均未達到顯著性差異，因此未再

12、進一步觀察其基因和蛋白表達水平的變化。 ④肝臟AMPKα1、AMPKα2和PPARα mRNA表達水平變化與對照組比較，HF組肝臟AMPKα2和PPARα mRNA表達水平分別減少83％和62.5％，均有顯著性差異(P＜0.05)，AMPKal減少49％(P＞0.05)。與HF組相比，加用二甲雙胍組AMPKα2 mRNA表達水平增高62％，有顯著的變化(P＜0.05)：AMPKα1和PPARα mRNA水平分別增加52％、46.

13、8％，但均無顯著性差異(P＞0.05)。提示長期高脂喂養(yǎng)可顯著降低大鼠肝臟AMPKα和PPARα的基因表達水平，二甲雙胍可明顯改善高脂導(dǎo)致的AMPKα基因表達的損害，PPARα的基因表達也得到較明顯的改善。 ⑤肝臟AMPKα和PPARα蛋白表達水平的變化與對照組相比，HF組AMPKα蛋白表達水平降低66.1％(P＜0.05)，PPARα降低48.6％(P＞0.05)；與HF組相比，加用二甲雙胍組AMPKα蛋白表達水平增高232％

14、(P＜0.05)，PPARα增高56.5％(P＞0.05)。提示長期高脂喂養(yǎng)可顯著降低大鼠肝臟AMPKα蛋白表達，PPARα的蛋白表達水平也有較明顯的下降，二甲雙胍可明顯改善高脂導(dǎo)致的AMPKα蛋白表達損害，PPARα的蛋白表達也得到較明顯的改善。 ⑥臨床研究的結(jié)果研究結(jié)束時，A組有90％的患者血糖轉(zhuǎn)為正常(NGT)，顯著高于B組的60％(P＜0.05)和D組的35％(P＜0.01)；A組有70％的患者血TG降至1.7mmol/

15、L以下，顯著高于D組的40％(P＜0.05)和顯著低于B組的95％(P＜0.05)：A組NAFLD的好轉(zhuǎn)率達92％，顯著高于B組的70％(P＜0.05)和D組的40％(P＜0.01)：同時，A組患者MS患病率減少到25％，顯著低于B組的40％(P＜0.05)和D組的55％(P＜0.01)。B組與D組比較，其NGT率(P＜0.05)、TG＜1.7mmol/L的患者比率(P＜0.01)和NAFLD的好轉(zhuǎn)率(P＜0.05)均顯著增高，MS患病

16、率相應(yīng)地顯著減少(P＜0.05)。D組患者血糖、血脂均較6個月前顯著增高，有15例患者由IGR轉(zhuǎn)為DM，D組的NAFLD也明顯加重。 結(jié)論： ①長期高脂環(huán)境可誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗，導(dǎo)致脂毒性和NAFLD的發(fā)生。 ②長期高脂環(huán)境可降低大鼠肝臟AMPKα和PPAReα的表達和活性，這是高脂誘導(dǎo)胰島素抵抗、脂毒性和NAFLD的可能機制之一。 ⑨二甲雙胍可增強大鼠肝臟AMPKα和PPARα的表達和活性，對高脂誘導(dǎo)的