二甲雙胍對高糖環(huán)境下頜骨成骨細胞影響的機制研究.pdf

1、糖尿病患者異常的高血糖狀態(tài)所引起的一系列病理變化是糖尿病患者牙種植失敗的重要原因。因此，有效地控制血糖、減輕種植體周圍因糖尿病而發(fā)生的病理變化，增強種植體骨愈合能力成為糖尿病患者牙種植治療的關(guān)鍵。采用胰島素或其他藥物系統(tǒng)治療可緩解糖尿病對口腔局部種植體愈合的不利影響，但作用有限。目前，臨床上還沒有理想的治療方法。為驗證劉洪臣提出的人工種植牙給藥的可行性，提高糖尿病患者牙種植的成功率，觀察糖尿病常用治療藥物對種植體局部骨細胞的代謝、增殖、

2、礦化的影響并研究其作用機制十分必要。 二甲雙胍(Metformin，MF)應(yīng)用臨床40余年，已經(jīng)證明能有效的降低血糖，改善胰島素抵抗，是目前治療2型糖尿病的一線用藥，但MF對成骨細胞的作用如何，國內(nèi)外少見報道。本實驗采用了大鼠下頜骨來源的成骨細胞，并在體外模擬高糖環(huán)境，再觀察MF對其慢性刺激后的大鼠下頜骨成骨細胞生物活性和葡萄糖攝取的影響，并探討其可能的作用機制，為MF經(jīng)人工種植牙給藥提供實驗依據(jù)。 第一部分、二甲雙胍對

3、高糖環(huán)境大鼠下頜骨成骨細胞增殖、分化和礦化的影響 目的：探討MF對高糖培養(yǎng)的大鼠下頜骨成骨細胞增殖、分化和礦化功能的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠下頜骨成骨細胞，分別給予5.5mM葡萄糖(5.5mMG)(生理糖濃度)、16.5mMG(高糖)濃度的培養(yǎng)液配制的不同濃度MF培養(yǎng)，用MTT法檢測成骨細胞的增殖，確定藥物最適濃度，RT-PCR檢測Ⅰ型膠原的表達，生化法測定堿性磷酸酶(ALP)活性、鈣吸收，放免法檢測骨鈣素含量，茜素紅

4、S鈣染法檢測礦化結(jié)節(jié)形成情況。 結(jié)果：一定濃度二甲雙胍能夠促進5.5mMG濃度培養(yǎng)的成骨細胞的增殖，Ⅰ型膠原基因表達，鈣吸收，礦化小結(jié)形成及鈣沉積；在高糖條件下，二甲雙胍促進成骨細胞的ALP活性，Ⅰ型膠原基因表達，但抑制骨鈣素的分泌、鈣吸收、礦化小結(jié)的形成及鈣沉積。 結(jié)論：在生理糖濃度下，MF促進大鼠下頜骨成骨細胞的增殖、分化和礦化，但高糖引起MF作用的改變，MF表現(xiàn)出促細胞分化但抑制礦化的作用。 第二部分、二甲

5、雙胍對高糖環(huán)境大鼠下頜骨成骨細胞葡萄糖攝取的影響 實驗一、高糖對大鼠下頜骨成骨細胞葡萄糖攝取的影響 目的：探討高糖對胰島素誘導(dǎo)的下頜骨成骨細胞葡萄糖攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter1，GLUT1)和GLUT3表達的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠下頜骨成骨細胞，分別予以5.5mM、16.5mMG處理細胞，持續(xù)24h，加入1×10-8mol/L胰島素(Ins)干預(yù)24h。采用氟-18(F-1

6、8)標(biāo)記的脫氧葡萄糖(18F-FDG)測定成骨細胞的葡萄糖攝取，GLUT1、GLUT3表達水平的檢測采用Western blot法。 結(jié)果：在5.5mMG培養(yǎng)時，Ins能夠顯著增加細胞對葡萄糖的攝取，同時也顯著增強細胞的GLUT1蛋白表達水平；在16.5mMG培養(yǎng)時，細胞的葡萄糖攝取無明顯變化，但GLUT1的表達明顯增加，Ins的應(yīng)用對葡萄糖攝取無明顯影響，但顯著下調(diào)了GLUT1的表達。 5.5mMG組未檢測到GLUT3

7、表達；16.5mMG時，有GLUT-3的表達，胰島素可以使GLUT3表達明顯上調(diào)。 結(jié)論：高糖能夠引起成骨細胞對胰島素的敏感性下降，誘導(dǎo)成骨細胞產(chǎn)生胰島素抵抗，其作用機制與GLUT1、GLUT3的活性和功能的改變有關(guān)。 實驗二、二甲雙胍對高糖環(huán)境大鼠下頜骨成骨細胞葡萄糖攝取的影響 目的：探討MF對高糖培養(yǎng)的下頜骨成骨細胞葡萄糖攝取和葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1(glucose transporter1，GLUT1)和GLUT

8、3表達的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠下頜骨成骨細胞，分別予以5.5mM、16.5mMG處理細胞，持續(xù)24h，加入或不加入400μmol/L MF和1×10-8mol/L胰島素(Ins)干預(yù)24h。采用氟-18(F-18)標(biāo)記的脫氧葡萄糖(18F-FDG)測定成骨細胞的葡萄糖攝取，GLUT1、GLUT3表達水平的檢測采用Western blot法。 結(jié)果：在5.5mMG培養(yǎng)條件下，MF、Ins及MF+Ins均顯著促進GLUT

9、-1表達，其中，MF和MF+Ins組的促GLUT-1表達效應(yīng)更強；在16.5mMG培養(yǎng)時，GLUT-1的表達明顯上調(diào)，MF、Ins和MF+Ins均能下調(diào)高糖培養(yǎng)條件下的GLUT-1表達，其中，MF和MF+Ins組與5.5mMG組比較無明顯差異，而Ins組則使GLUT-1表達進一步下調(diào)，較5.5mMG組比較明顯下降。 5.5mM時未檢測到GLUT3表達；16.5mM時，有GLUT-3的表達，MF、Ins、MF+Ins均顯著促進GL