鹽酸二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境下顱骨成骨細(xì)胞功能影響的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化的影響 目的：探討二甲雙胍對(duì)高糖培養(yǎng)的大鼠顱骨成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化功能的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞，分別給予不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基：生理濃度葡萄糖(5.5 mmol/L)以及高濃度葡萄糖(11、22、44 mmol/L)，在此基礎(chǔ)上用不同濃度的二甲雙胍(0、10、40、160、320、640μmol/L)干預(yù)體外培養(yǎng)的原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞，MTT法

2、檢測大鼠顱骨成骨細(xì)胞的增殖、磷酸對(duì)硝基苯酯(PNPP)法測定堿性磷酸酶(ALP)活性、茜素紅S鈣染法檢測礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)目、鹽酸脫鈣法檢測礦化結(jié)節(jié)鈣含量、SYBR Green I嵌和熒光法進(jìn)行real time PCR測定基因Runx2、IGF-1以及IGF-1R的表達(dá)水平。 結(jié)果：在含11 mmol/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞，與5.5 mmol/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基培養(yǎng)的原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞比較，細(xì)胞的增殖

3、、堿性磷酸酶活性、鈣化結(jié)節(jié)形成的數(shù)目、鈣化結(jié)節(jié)中的鈣含量都明顯增加，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在更高葡萄糖濃度培養(yǎng)基(22，44 mmol/L)中培養(yǎng)原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的增殖、堿性磷酸酶活性、鈣化結(jié)節(jié)形成的數(shù)目、鈣化結(jié)節(jié)中的鈣含量以劑量依賴的形式明顯減少，并有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用不同濃度的二甲雙胍干預(yù)后，在一定濃度范圍內(nèi)，二甲雙孤能夠促進(jìn)5.5 mmol/L葡萄糖濃度培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖，ALP活性，礦化小結(jié)形成及鈣沉積；高糖條件下，二甲雙

4、孤同樣促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，ALP活性，礦化小結(jié)形成及鈣沉積；進(jìn)一步，我們評(píng)價(jià)了在5.5mmol/L、11mmol/L、44 mmol/L的葡萄糖濃度下二甲雙胍(0、10、40、160、320、640μmol/L)干預(yù)后的細(xì)胞基因Runx2、IGF-1、IGF-1R的表達(dá)水平。與5.5mmol/L的葡萄糖比較，11mmol/L葡萄糖明顯促進(jìn)Runx2、 IGF-1的表達(dá)，44mmol/L葡萄糖明顯抑制Runx2、IGF-1、IGF-1R的表

5、達(dá)；二甲雙胍能夠顯著促進(jìn)三種不同葡萄糖濃度下的成骨細(xì)胞的Runx2、IGF-1的表達(dá)，而對(duì)IGF-1R不產(chǎn)生影響。 結(jié)論：本研究證實(shí)葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞的增殖，分化與礦化的影響以劑量依賴的形式產(chǎn)生雙向影響；二甲雙胍在一定的濃度范圍內(nèi)能夠?qū)υ晒羌?xì)胞有直接的成骨作用，能夠逆轉(zhuǎn)高濃度的葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞功能的損害，這種成骨作用可能部分通過促進(jìn)Runx2和IGF-1基因的表達(dá)。 第二部分二甲雙胍對(duì)高糖環(huán)境大鼠顱骨成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和

6、凋亡的影響 目的：探討高糖對(duì)大鼠顱骨成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響以以及二甲雙胍對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠顱骨成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。 方法：分離培養(yǎng)大鼠顱骨成骨細(xì)胞，分別給予不同濃度的葡萄糖培養(yǎng)基：生理濃度葡萄糖(5.5mmol/L)以及高濃度葡萄糖(11、22、44 mmol/L)，在此基礎(chǔ)上用不同濃度的二甲雙胍(0、10、40、160、320、640μmol/L)干預(yù)體外培養(yǎng)的原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞，運(yùn)用DCFH-DA作為

7、熒光探針，采用流式細(xì)胞檢測技術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平，Annexin V-FITC/PI雙染色分析細(xì)胞早期凋亡率。 結(jié)果：與5.5mmol/L的葡萄糖比較，11mmol/L葡萄糖濃度的培養(yǎng)基中培養(yǎng)原代大鼠顱骨成骨細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(ROS)的形成和細(xì)胞調(diào)亡的發(fā)生略有減少，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在更高的葡萄糖濃度下的培養(yǎng)基(22、44mmol/L)中培養(yǎng)原代大鼠成骨細(xì)胞