二甲雙胍對(duì)高糖介導(dǎo)的成骨細(xì)胞MG63增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響.pdf

1、隨著生活水平的提高，生活方式西方化及人口老齡化，人類健康面臨的慢性疾病威脅正日益加重，其中糖尿病及其慢性并發(fā)癥更是危害健康的無(wú)情殺手。已證實(shí)長(zhǎng)期高血糖通過(guò)多種方式引起骨代謝紊亂，如糖毒性、高滲性及晚期糖基化終產(chǎn)物(AGEs)等。體外實(shí)驗(yàn)也表明，高濃度葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化產(chǎn)生明顯的抑制作用。骨保護(hù)素(OPG)、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)及核因子-κB受體活化因子(RANK)是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的調(diào)控破骨細(xì)胞分化激活的

2、細(xì)胞因子，其在骨代謝中起重要作用。在骨組織中，成骨細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)RANKL，與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞或破骨細(xì)胞表面上的RANK結(jié)合后，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化和激活，并抑制破骨細(xì)胞的凋亡。由成骨細(xì)胞分泌的OPG可與RANKL結(jié)合，競(jìng)爭(zhēng)性抑制RANKL與RANK的結(jié)合，減少破骨細(xì)胞生成，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松的作用。
　　二甲雙胍（metformin,MET）作為治療糖尿病的一線藥物，其通過(guò)激活A(yù)MP激活蛋白激酶（activated prote

3、in kinase, AMPK）信號(hào)系統(tǒng)發(fā)揮降糖作用。新的研究表明二甲雙胍能夠降低1型及2型糖尿病患者骨折的發(fā)生率，對(duì)骨骼產(chǎn)生有益影響，其具體機(jī)制可能為二甲雙胍激活A(yù)MPK信號(hào)通路繼而引起內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide sythase, eNOS)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein-2, BMP-2)表達(dá)增加，影響成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化過(guò)程，對(duì)骨代謝發(fā)揮一定保

4、護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察高糖環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化及礦化標(biāo)志物、相關(guān)基因表達(dá)的影響，以及二甲雙胍干預(yù)后相應(yīng)基因表達(dá)的變化，進(jìn)一步探討在高糖環(huán)境中二甲雙胍對(duì)成骨細(xì)胞代謝的保護(hù)作用。
　　一、葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞MG63增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的：探討不同濃度葡萄糖對(duì)成骨細(xì)胞MG63增殖的影響及細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的變化。
　　方法：(1)以不同濃度葡萄糖(5.5、16.7、33.3、5.5/16.7、5.5/33.3m

5、mol/L)干預(yù)細(xì)胞MG63為干預(yù)組，設(shè)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為對(duì)照組，應(yīng)用細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞增殖；(2)以不同濃度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干預(yù)細(xì)胞MG63為干預(yù)組，同時(shí)設(shè)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為對(duì)照組，應(yīng)用生化分析儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)的含量；(3)以不同濃度葡萄糖(5.5、16.7、33.3mmol/L)干預(yù)細(xì)胞MG63為干預(yù)組，同時(shí)設(shè)磷酸緩沖鹽溶液(PBS)為對(duì)

6、照組，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)Ⅰ型膠原(COLⅠ)、骨鈣素(OCN)、骨保護(hù)素(OPG)、核因子-κB受體活化因子配體(RANKL)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果：(1)收集葡萄糖作用3天后的MG63細(xì)胞株，CCK-8法檢測(cè)結(jié)果顯示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖組抑制細(xì)胞增殖(P<0.05)，且5.5/16.7mmol/L、5.5/33.3mmol/L葡萄糖交替培養(yǎng)組抑制作用更明顯(P<0.01)，而5.5mmol/L葡萄糖濃度組無(wú)顯

7、著變化；(2)不同濃度葡萄糖分別干預(yù)MG63細(xì)胞6、12、18天后，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ALP的活性，結(jié)果顯示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖組細(xì)胞表達(dá)ALP均降低(P<0.05)，尤其在第6、12天時(shí)，33.3mmol/L組變化較顯著(P<0.01)；(3) RT-PCR結(jié)果顯示：16.7、33.3mmol/L葡萄糖組OPG、OCN表達(dá)下調(diào)(P<0.05)，尤其在33.3mmol/L濃度時(shí)更顯著(P<0.01)；而RANKL在33.3mm

8、ol/L時(shí)表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，COLⅠ無(wú)明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論：高糖及波動(dòng)性高糖明顯抑制成骨細(xì)胞增殖，高糖環(huán)境可下調(diào)成骨細(xì)胞內(nèi)ALP活性、OCN基因的表達(dá)，表明高糖可減少成骨細(xì)胞數(shù)量，同時(shí)減緩成骨細(xì)胞基質(zhì)成熟、礦化，從多個(gè)階段減弱成骨細(xì)胞的成骨能力。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高糖下調(diào)OPG的表達(dá)、上調(diào)RANKL的表達(dá)，使OPG/RANKL比值下降，從而激活破骨細(xì)胞，促進(jìn)破骨細(xì)胞的分化、成熟，加快骨吸收，可能是糖尿病

9、性骨質(zhì)疏松的重要發(fā)病機(jī)制之一。
　　二、二甲雙胍對(duì)高糖介導(dǎo)的成骨細(xì)胞MG63增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　目的：觀察二甲雙胍對(duì)高糖介導(dǎo)下成骨細(xì)胞MG63增殖及相關(guān)基因表達(dá)的影響，探討高糖環(huán)境中二甲雙胍對(duì)骨代謝的保護(hù)作用。
　　方法：(1)實(shí)驗(yàn)分組均以不同濃度二甲雙胍(0、200、300、400mmol/L)干預(yù)高糖(16.7mmol/L)環(huán)境中MG63；（2）應(yīng)用CCK-8檢測(cè)成骨細(xì)胞增殖；(3)應(yīng)用生化分析儀檢測(cè)成骨

10、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(ALP)的含量；(4)應(yīng)用 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞Ⅰ型膠原(CoLⅠ)、骨鈣素(OCN)及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)的表達(dá)；
　　結(jié)果：(1) CCK-8結(jié)果顯示：各濃度組細(xì)胞生長(zhǎng)較高糖對(duì)照組均顯著增加(P<0.01)，提示二甲雙胍可逆轉(zhuǎn)高糖環(huán)境對(duì)成骨細(xì)胞增殖的抑制；(2) SFBC速率法檢測(cè)顯示：ALP活性較對(duì)照組有所增加(P<0.05)，尤其是第6天及第12天200、300mmol/L二甲雙胍組ALP活性增加

11、較顯著(P<0.01)，表明二甲雙胍可能增加成骨細(xì)胞骨形成周期中ALP活性；(3) RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：二甲雙胍干預(yù)后COLⅠ、OCN表達(dá)上調(diào)(P<0.05)，其中COLⅠ在400mmol/L二甲雙胍、OCN在300mmol/L二甲雙胍組時(shí)表達(dá)最高(P<0.01)；MMP-1、MMP-2、MMP-3表達(dá)較對(duì)照組均有下調(diào)(P<0.05或P<0.01)，MMP-8表達(dá)在400mmol/L MET組表達(dá)下調(diào)(P<0.05)。