人組織相容性Ⅰ類相關(guān)鏈A位點抗原性在移植免疫中的基礎(chǔ)與臨床研究.pdf

1、目的:利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)對MICA*008胞外區(qū)序列進行重組蛋白的表達(dá),為研究抗MICA抗體介導(dǎo)體液免疫奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。通過對腎移植受者移植前后抗MICA抗體的隨訪檢測,結(jié)合MICA基因分型分析腎移植術(shù)前和術(shù)后新生抗MICA特異性抗體在移植腎功能減退中的意義。通過對國際協(xié)作組抗MICA抗體結(jié)果進行整體匯總和對比分析,對在臨床推廣應(yīng)用的MICA特異性抗體檢測起一定的指導(dǎo)作用。
　　方法:
　　第一部分:選取人群中最常

2、見的MICA*008等位基因,利用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)進行MICA*008胞外區(qū)序列的重組蛋白的表達(dá),首先將轉(zhuǎn)移載體pFastBac-MICA*008轉(zhuǎn)化到E.coilDH10Bac中進行轉(zhuǎn)座,通過藍(lán)白斑篩選和測序鑒定,獲得Bacmid-MICA*008,用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞SF9,收獲培養(yǎng)上清,鎳柱純化上清中的表達(dá)產(chǎn)物,經(jīng)Westernblot和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定重組蛋白。
　　第二部分:采用免疫磁珠流式細(xì)胞儀液相芯片技術(shù)

3、(Luminex技術(shù)),對82例腎移植受者進行移植前抗MICA抗體檢測和移植后四年的動態(tài)隨訪,結(jié)合供受者MICA基因分型分析移植后新生抗MICA特異性抗體類型,分析其與移植腎功能的相關(guān)性。在移植后1個月,3個月,6個月,12個月,24個月,36個月,48個月等動態(tài)隨訪點比較抗體陰性組和抗MICA抗體陽性組血清肌酐平均值的差異,并分析統(tǒng)計學(xué)差異。
　　第三部分:對16屆國際組織相容性和遺傳免疫協(xié)作組發(fā)放的16份血清樣本采用Lumin

4、ex技術(shù)檢測抗MICA抗體的特異性。將此次協(xié)作組結(jié)果匯總,按各實驗室使用的三種抗MICA抗體試劑類型將結(jié)果分類分析,三種試劑分別標(biāo)記為Kit-A,B,C。結(jié)合本實驗室及協(xié)作組結(jié)果,分析三種檢測試劑檢測抗MICA特異性抗體結(jié)果的異同。
　　結(jié)果:
　　第一部分:轉(zhuǎn)座后的Bacmid-MICA*008經(jīng)測序鑒定和Blast比對,插入序列與MICA*008序列一致。收集轉(zhuǎn)染后P3代的病毒上清液,經(jīng)鎳柱純化最終獲得重組MICA08蛋

5、白約1.5mg/L左右,經(jīng)Westernblot和考馬斯亮藍(lán)染色鑒定,重組蛋白片段大小約37kDa,與目的蛋白大小相符。
　　第二部分:研究表明抗MICA抗體存在于12.2％(10/82)的腎移植前患者中。10例移植前抗MICA抗體陽性受者中有3例移植后新生抗MICA抗體,另外7例隨訪期間抗MICA抗體的特異性類型均無改變。1例移植術(shù)前抗體陰性移植后3個月新生抗MICA抗體。結(jié)合供受者MICA基因分型判斷有2例受者新生的抗體為抗供

6、者特異性抗體且出現(xiàn)相關(guān)的臨床排斥反應(yīng),2例受者新生的為非供者特異性抗體。抗MICA抗體陽性組平均血清肌酐水平均高于抗體陰性組,在隨訪至36~48個月后具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　第三部分:在16份血清標(biāo)本中S04為陰性,15份標(biāo)本結(jié)果陽性,其中S10標(biāo)本各實驗室均上報為陽性。依據(jù)MICA抗原公共表位分G1組(MICA-01,02,07,12,17,18)和G2(MICA-04,06,08/27,09,19)組,5例標(biāo)本用Kit-A和B均

7、能判別MICA-G1組特異性抗體,Kit-C存在MICA08/27,MICA19的假陽性結(jié)果。5例標(biāo)本用Kit-A和B均能判別MICA-G2組特異性抗體。其余5例標(biāo)本用Kit-A,B,C均無法判別MICA特異性抗體一致的結(jié)果。從三種試劑均能判別10種MICA特異性抗體結(jié)果分析,MICA08/27(86.67%,13/15)抗體結(jié)果一致性最高,MICA19(40%,6/15)一致性最低。使用Kit-B試劑的實驗室間有13例MICA特異性抗

8、體標(biāo)本結(jié)果符合率大于80%。
　　結(jié)論:1.應(yīng)用桿狀病毒-昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)可高效表達(dá)重組MICA08蛋白,而通過鎳柱親和層析純化P3病毒上清液可制備高純度的重組MICA08蛋白。2.應(yīng)用免疫磁珠流式細(xì)胞儀液相芯片技術(shù)可檢測抗MICA特異性抗體,供、受者MICA基因錯配是產(chǎn)生新生抗體的重要原因,預(yù)存和新生抗MICA抗體與移植后腎功能減退密切相關(guān),而新生的DSA抗MICA抗體是移植排斥反應(yīng)的重要原因。3.三種檢測抗MICA特異性抗體試