主要組織相容性復(fù)合體I類(lèi)分子相關(guān)A基因(MICA)抗體與臨床肝移植排斥的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：本研究旨在通過(guò)對(duì)主要組織相容性復(fù)合體I 類(lèi)分子相關(guān)A基因（MICA）的多態(tài)性檢測(cè)，探討MICA 抗體在肝移植排斥反應(yīng)過(guò)程中的作用機(jī)制。本研究包括：
　　 1）通過(guò)對(duì)主要組織相容性復(fù)合體I 類(lèi)分子相關(guān)A基因（MICA）轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系檢測(cè)肝移植病人的血清，運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)是否產(chǎn)生針對(duì)MICA的抗體來(lái)探討MICA 抗體在肝移植免疫排斥反應(yīng)中的影響機(jī)制。
　　 2）運(yùn)用PCR 方法檢測(cè)22例發(fā)生肝移植排斥反應(yīng)供、受體病人血

2、清中的MICA的等位基因型，確定MICA*008 等位基因在肝移植排斥反應(yīng)中的作用機(jī)制。
　　 3）運(yùn)用免疫組織化學(xué)方法進(jìn)一步證實(shí)MICA 抗原與肝移植排斥反應(yīng)的關(guān)系。
　　 方法：
　　 課題第一部分：
　　 1）轉(zhuǎn)染MICA的人類(lèi)B 淋巴母細(xì)胞細(xì)胞系（721.221）通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)后，同84例接受肝移植手術(shù)的病人的血清進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)分為五組，第一組：
　　 MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞（5×10

3、5個(gè)）+羊抗鼠抗體2 微升（二抗，熒光抗體）；第二組：MICA轉(zhuǎn)染細(xì)胞（5×105個(gè)）+抗MICA 抗體（一抗，熒光抗體）+羊抗鼠抗體2 微升（二抗，熒光抗體）；第三組：MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞（5×105個(gè)）+AB 血清（陰性對(duì)照）+羊抗人（IgG+IgM）10 微升（二抗）；第四組：MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞（5×105個(gè)）+陽(yáng)性對(duì)照病人血清+羊抗人（IgG+IgM）10 微升（二抗）；第五組：MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞（5×105個(gè)）+抗MICA 抗體

4、（一抗，熒光抗體）+產(chǎn)生排斥反應(yīng)的病人的血清+羊抗人（IgG+IgM）10 微升（二抗）。各組再用抗MICA 單克隆抗體封閉，以檢測(cè)血清中的抗體是否是MICA 特異性抗體。
　　 2）MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞（BEC）、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）和肝細(xì)胞與5μl的抗MICA 抗體結(jié)合，加入螢光抗體羊抗鼠IgG，分別行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，MICA的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞和MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照。
　　 課題第二部分

5、：
　　 1）將22例發(fā)生肝移植排斥反應(yīng)病人供體、受體的血清分別提取DNA 并以分光光度計(jì)進(jìn)行檢測(cè)，采用PCR 方法和標(biāo)有MICA 等位基因序列的引物進(jìn)行電泳檢測(cè)，分析記錄電泳圖，并與MICA 等位基因圖譜相對(duì)照得出各自的MICA 等位基因型。
　　 2）從健康肝臟中分別提取膽管上皮細(xì)胞（BEC）、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞（LSEC）和肝細(xì)胞，細(xì)胞經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后，提取RNA 及cDNA 合成, 以葡萄糖-6-磷酸鹽脫氫酶（G6PD）被當(dāng)

6、作內(nèi)生的正常對(duì)照，MICA的第一代細(xì)胞系和MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞分別作為陰性和陽(yáng)性對(duì)照組，分別行RT-PCR檢測(cè)和免疫印記檢測(cè)。
　　 課題第三部分：將已經(jīng)病理檢查確診的13例肝移植并發(fā)生排斥反應(yīng)病人的肝穿刺標(biāo)本、15例沒(méi)有發(fā)生排斥反應(yīng)的肝移植病人的肝穿刺標(biāo)本和11例患有結(jié)腸癌病人的結(jié)腸標(biāo)本行免疫組織化學(xué)檢查。其中沒(méi)有發(fā)生排斥反應(yīng)病人的標(biāo)本設(shè)為陽(yáng)性對(duì)照，患有結(jié)腸癌病人的結(jié)腸標(biāo)本作為陰性對(duì)照。
　　 結(jié)果：
　　 1）

7、總共22例（22/84）（26%）術(shù)前或/和術(shù)后病人產(chǎn)生MICA 抗體，其中8例（8/84）（9.5%）為術(shù)前病人，14例（14/84）（17%）為術(shù)后病人，84例病人中，共有43例（43/84）發(fā)生排斥反應(yīng)，在有MICA 抗體組中，排斥發(fā)生率為63%（14/22），在沒(méi)有MICA 抗體組中，排斥發(fā)生率為47%（29/62），二者相比沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 在非轉(zhuǎn)染細(xì)胞組（721.221）沒(méi)有發(fā)現(xiàn)MICA 表達(dá)，而在轉(zhuǎn)染組提示有

8、高表達(dá); 用抗MICA 單克隆抗體封閉后，血清與MICA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系的結(jié)合被抑制，提示在這些病人血清中檢測(cè)到的抗體是MICA 特異性抗體。在MICA 抗體陽(yáng)性組和陰性組中，無(wú)論發(fā)生排斥反應(yīng)及病人的存活與否，兩組之間都沒(méi)有臨床聯(lián)系。
　　 2）流式細(xì)胞儀分析顯示，MICA的表達(dá)在MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面上；而做為陰性對(duì)照，膽管上皮細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞或肝細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生任何變化，提示MICA的表達(dá)并不在這些細(xì)胞表面上。
　　

9、 3）在肝移植供、受體中出現(xiàn)頻率最高的MICA 等位基因是MICA*008，在9例病人供體和受體的抗體當(dāng)中檢測(cè)到了MICA*008，其中，4例病人的供體和受體檢測(cè)出MICA*008 完全相配；發(fā)現(xiàn)在4例病人中，供體不匹配的MICA 等位基因是MICA*008；5例病人中，供體不匹配的MICA 等位基因不是MICA*002 就是MICA*010。在14/22（63%）例發(fā)生排斥反應(yīng)的病人中可以檢測(cè)到MICA*008 細(xì)胞系抗體，而在29/

10、62（47%）例病人中沒(méi)有檢測(cè)到MICA*008 細(xì)胞系抗體，二者之間沒(méi)有顯著性差異（P＞0.05）。
　　 4）提取的新鮮肝臟細(xì)胞和抗MICA 單克隆抗體經(jīng)過(guò)免疫印跡法檢測(cè)顯示，62kDa 條帶與MICA 多肽的相一致，這一結(jié)果僅見(jiàn)于MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞而不是膽管上皮細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞和肝細(xì)胞。
　　 5）在那些發(fā)生排斥反應(yīng)和沒(méi)有發(fā)生排斥反應(yīng)的肝移植病人標(biāo)本中僅發(fā)現(xiàn)輕度的MICA 抗原染色，而那些患有結(jié)腸癌并當(dāng)作陰性對(duì)照

11、組的病人，免疫組化顯色后顯示在上皮細(xì)胞有很強(qiáng)和散在的細(xì)胞質(zhì)染色。
　　 結(jié)論：
　　 1）MICA的表達(dá)僅在MICA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表面上，而在膽管上皮細(xì)胞、肝竇內(nèi)皮細(xì)胞或肝細(xì)胞并沒(méi)有發(fā)生表達(dá)，提示MICA的表達(dá)并不在這些細(xì)胞表面上。
　　 2）MICA 抗原僅在肝移植病人及發(fā)生排斥反應(yīng)的肝移植病人的肝組織中發(fā)生微弱的表達(dá)，但卻在結(jié)腸癌病人的結(jié)腸上皮組織中發(fā)生強(qiáng)烈表達(dá)。
　　 3）統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，在肝移植預(yù)留抗