不同齲敏感兒童牙菌斑細菌類群組成多樣性研究.pdf

1、齲病是一種極大危害人類口腔健康和全身健康的常見病、多發(fā)病,對齲病的主要病原因子--牙菌斑特性的研究一直是口腔醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點.現(xiàn)代齲病學(xué)的研究認為,菌斑中的正常菌叢組成存在著動態(tài)平衡,當(dāng)這一平衡受到干擾時,大量具有致齲潛力的產(chǎn)酸耐酸菌毒力和數(shù)量顯著增多,非致齲性菌斑就會向致齲性菌斑轉(zhuǎn)變,從而發(fā)生齲病.目前口腔中存在的微生物多達700種以上,其中至少有一半以上的微生物仍然是不可培養(yǎng)或者難于培養(yǎng)的,因而對這一菌斑生態(tài)失衡致齲學(xué)說的驗證僅限于

2、幾種主要的致齲菌,尚缺乏對于齲病發(fā)生發(fā)展過程中菌群組成變化及作用的全面認識,以及對齲病易感人群患齲風(fēng)險較為全面的微生物學(xué)評估標(biāo)準. 現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的進步使得研究者們可以全局性的探索生態(tài)群落中微生物種群的變遷.本研究選擇不同齲敏感兒童牙菌斑作為研究對象,采用變性梯度膠電泳(denaturing gradient gel electropho-resis,DGGE)分子生物學(xué)策略分析16S rDNA、mpB特征序列,從"屬"、"

3、種"的水平分別對菌斑中細菌類群以及口腔鏈球菌屬群落進行鑒定;并進一步應(yīng)用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time polymerasechain reaction,Real-time.PCR)、熒光原位雜交(nuorescence in situhybridization,:FISH)、流式細胞儀(Flow cytometer,FCM)等多種分子生物學(xué)方法對其中的主要致齲菌進行定量分析.研究主要結(jié)果如下: 第一部分齲易感兒童

4、牙菌斑細菌群落組成多樣性PCR-DGGE分析 本部分實驗通過兒童齲高危人群臨床資料的隊列研究,獲得各15名無齲(dmrs=0)、中齲(4≤dmfs≤6)以及高齲(dmfs≥8)菌斑樣本,利用PCR-DGGE技術(shù)結(jié)合16S rDNA,動態(tài)分析不同致病條件下菌斑中細菌群落組成多樣性.結(jié)果顯示,健康兒童組不同個體之間牙菌斑細菌種群整體結(jié)構(gòu)基本一致,優(yōu)勢菌屬為鏈球菌屬中的口腔鏈球菌群(Oralis streptococus) 和變異鏈球

5、菌群 (Mutans streptococus)、放線菌屬 (Actinom,yces)、噬二氧化碳細胞菌屬(亦稱二氧化碳噬纖維菌屬,Capnocytophaga)、彎曲桿菌屬 (Campylobacter)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、奈瑟菌屬 (Neisseria)、纖毛菌屬 (Leptotrichia)、嗜血桿菌屬 (Haemophilus)、普氏菌屬 (Prevotella)和棒桿菌屬(Corynebacterium

6、). 其中變異鏈球菌群與放線菌屬在中齲、高齲兒童中均有著穩(wěn)定的檢出率,是主要的致齲菌;口腔鏈球菌群與齲病的發(fā)生呈負相關(guān).而且隨著菌斑的致齲化轉(zhuǎn)變,高齲組的遺傳多樣性顯著減少(P<0.05). 第二部分齲易感兒童牙菌斑口腔鏈球菌屬群落組成多樣性PCR-DGGE分析 鏈球菌屬系統(tǒng)分類發(fā)育標(biāo)記分子rnpB基因,可以將鏈球菌精確鑒定到菌種的水平.在第一部分的研究基礎(chǔ)上,本部分實驗進一步對主要致齲菌屬--口腔鏈球菌屬(Or

7、al streptococci)的細菌類群多樣性進行了分析.結(jié)果顯示,在45例無齲、中齲以及高齲兒童牙菌斑中,共鑒定出23種鏈球菌,分別歸屬于口腔鏈球菌群:血鏈球菌(streptococcus.sanguis,s.sanguis),輕鏈球菌(Streptococcus mitis,S.mitis),口腔鏈球菌(streptococcus oralis,S.oralis),嵴鏈球菌(Streptococcus scrista,S.scri

8、sta);變異鏈球菌群:變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S.mutans),遠緣鏈球菌(Streptococcus sobrinus,S.sobrinus);中間鏈球菌群(Intermedius streptococcus):咽峽炎鏈球菌(Streptococcus anginosus,S.anginosus).其中口腔鏈球菌群和變異鏈球菌群在無齲、中齲和高齲組中有著較高的檢出率,是菌斑中的常居優(yōu)勢菌叢,中間鏈球菌

9、群只在個別樣本中檢出. 兒童無齲組血鏈球菌、輕鏈球菌、口腔鏈球菌的基因型顯著高于中齲和高齲組(P<0.05);而變異鏈球菌和遠緣鏈球菌的基因型在三組之間雖然并無區(qū)別(P>0.05),但在后兩組中條帶亮度明顯增加,說明變異鏈球菌和遠緣鏈球菌在菌斑的致齲化轉(zhuǎn)變過程中,仍然繼續(xù)保持優(yōu)勢生長狀態(tài),是主要的致齲菌,而且二者常?？梢圆⑿袡z出提示這兩種細菌可能存在著共生、協(xié)同致齲作用. 第三部分齲易感兒童牙菌斑中變異鏈球菌的定量檢測

10、 變異鏈球菌作為公認的主要致齲菌,其在口腔存在的數(shù)量和比例,可以作為齲齒活躍性評估的參考數(shù)據(jù)之一.本部分試驗通過不同熒光素標(biāo)記的寡核苷酸探針:變異鏈球菌特異性探針MUT590和細菌通用探針EUB388,與無齲組、高齲組兒童菌斑中變異鏈球菌與總菌雜交,結(jié)合流式細胞儀定量檢測.結(jié)果顯示在無齲兒童組菌斑中,變異鏈球菌在總菌中所占的比例分別是1.24﹪～3.4﹪,而在高齲兒童菌斑中比例為5.04﹪～9.7﹪,兩組比較有著明顯的統(tǒng)計學(xué)差異(

11、P<0.01).熒光原位雜交技術(shù)結(jié)合流式細胞術(shù),數(shù)據(jù)可靠、特異性高、省時,是一種定量分析變異鏈球菌的理想方法. 第四部分齲易感兒童牙菌斑四種主要致齲菌實時PCR定量檢測 齲病是一種多種細菌共同作用所引起的慢性感染性疾病,本部分實驗應(yīng)用Real-time PCR定量檢測變異鏈球菌、遠緣鏈球菌、黏性放線菌(Actinomyces viscosus,Aviscosus)和內(nèi)氏放線菌(Actinomycesnaeslundii,

12、Anaeslundii).結(jié)果顯示變異鏈球菌在中齲組中所占的百分比例為8.84±5.99,顯著高于無齲組(P<0.01),數(shù)值與第三部分應(yīng)用熒光原位雜交和流式細胞儀定量檢測所得的齲病高危人群的臨界參數(shù)接近;但與高齲組相比,變異鏈球菌比例雖有明顯增長,卻和dmfs指數(shù)的增加并非呈線性關(guān)系,統(tǒng)計學(xué)分析亦無顯著差異(P<0.05);遠緣鏈球菌作為另一主要致齲菌,其檢出率及數(shù)量水平雖不如變異鏈球菌(P<0.01),但在無齲、中齲和高齲三組中與變

13、異鏈球菌有著一致的統(tǒng)計學(xué)變化趨勢,并且常在檢出變鏈菌的個體中檢出,二者之和所占總菌的比例,在三組之間兩兩比較不但均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),而且和dmfs指數(shù)的變化有著良好的線性關(guān)系,提示這兩種細菌在致齲方面可能具有協(xié)同作用,而且二者數(shù)量之和所占總菌的比例更適合用于齲齒活躍性的評估. 黏性放線菌、內(nèi)氏放線菌作為菌斑形成過程中的先鋒菌,在高齲組中的比例顯著高于無齲組(P<0.01),說明在酸化的致齲性菌斑中,二者仍然可以保持良