采用組織工程技術(shù)重建外周神經(jīng).pdf

1、長距離的外周神經(jīng)缺損，目前臨床常用自體腓腸神經(jīng)作游離移植或多股移植神經(jīng)行電纜式縫合。但是這些方法受限于自身外周神經(jīng)的供源不足及供體神經(jīng)供區(qū)的功能喪失甚至壞死。同時，重建組織或器官移植后的功能全面恢復(fù)也必須依賴于外周神經(jīng)的支配與調(diào)節(jié)。本研究課題在利用已有的去細胞坐骨神經(jīng)支架移植入體內(nèi)2個月后軸突的成功再生及神經(jīng)功能部分恢復(fù)的兔模型基礎(chǔ)上，研究將受體自身Schwanncell粘附于同種異體去細胞坐骨神經(jīng)支架后植入受體體內(nèi)，通過對重建坐骨神經(jīng)

2、不同時間點的軸突生長水平，神經(jīng)傳導(dǎo)速度以及重建神經(jīng)支配區(qū)的痛覺、溫度覺、肌力等組織學(xué)，電生理和神經(jīng)行為的檢測與評估，闡明SchwannceU在加快植入重建坐骨神經(jīng)功能恢復(fù)中的重要性，為外周神經(jīng)損傷后植入重建神經(jīng)以及組織和器官移植后功能全面恢復(fù)的可行性提供了實驗基礎(chǔ)和理論依據(jù)。 第一部分同種異體兔去細胞坐骨神經(jīng)支架模型的建立 方法：從供體兔切取5cm長坐骨神經(jīng)后，將坐骨神經(jīng)浸入4℃蒸溜水中2448小時，然后放入0．05％n

3、ypsin溶液中，在37℃環(huán)境下，以250rpm速度振蕩處理24小時，再將神經(jīng)移入1％niton和0．1％AmmoniumHydroxide混合液中，在4℃環(huán)境下振蕩72小時后，反復(fù)用蒸溜水洗滌，再將神經(jīng)放入1×PBs液中振蕩8小時，然后將神經(jīng)放入一20℃冷凍柜中冷凍20．30分鐘，取出神經(jīng)后凍干24小時，用2％PLGA涂于神經(jīng)表面并密封處理神經(jīng)，再用乙烯氧化物冷氣消毒，包裝、貯藏至使用。 結(jié)果：經(jīng)過多步驟的去細胞過程，并通過組

4、織學(xué)、免疫組化及免疫熒光染色證實：已基本溶解了坐骨神經(jīng)內(nèi)所有細胞，神經(jīng)支架仍保持原有完整的鞘和內(nèi)部結(jié)構(gòu)。但是去細胞坐骨神經(jīng)支架的機械性能相當脆弱，故用2％PLGA涂于去細胞神經(jīng)支架表面以恢復(fù)去細胞神經(jīng)支架的柔韌性，同時電鏡證實：2％PLGA處理后的去細胞神經(jīng)支架表面仍然有大量多孔狀結(jié)構(gòu)的存在，不妨礙細胞的粘附和移入。 結(jié)論：用0．05％nypsin，1％niton和0．1％AmmoniumHydBOXide及凍干技術(shù)可以成功地制

5、備出同種異體去細胞坐骨神經(jīng)支架，同時用2％PLGA涂于去細胞神經(jīng)支架表面，可以恢復(fù)去細胞坐骨神經(jīng)支架的柔韌性，又不影響原有的多孔、疏松的精細超微狀結(jié)構(gòu)，為手術(shù)成功創(chuàng)造了最理想的條件。 第二部分受體兔自體SchwannceU的收集、體外培養(yǎng)和擴增方法的建立 方法：無菌切取坐骨神經(jīng)。放入消化液中在37℃水浴中振蕩消化30分鐘。吸去消化液后，用10％FBs／DMEM液反復(fù)清洗3次，再用吸管反復(fù)吹打組織，過濾收集濾液，離心(15

6、00轉(zhuǎn)／min×10min)后，棄去上清液，用1m10％FBS/DMEM液混懸沉淀細胞并種植于用PDL處理過的培養(yǎng)皿中，靜置24小時后，加入Ara-c繼續(xù)培養(yǎng)48—72小時，洗滌去除Ara-c后加入SchwannCCIl培養(yǎng)液(10％FBS／DMEM竹hNGF十5mMForskolin)繼續(xù)培養(yǎng)到細胞生長成單層時進行傳代。 結(jié)果：10天后，光鏡下發(fā)現(xiàn)：培養(yǎng)的原代細胞貼壁生長，長出突起，胞體較小，大多呈雙極，邊界清晰，折光度強，細

7、胞排列整齊，單層培養(yǎng)，無重疊生長一接觸抑制；免疫細胞化學(xué)(抗S100)染色提示：培養(yǎng)的原代細胞s100呈陽性反應(yīng)；免疫印跡法證實：培養(yǎng)的原代細胞中有Schwanncell標記蛋白S100存在。 結(jié)論：用消化液，schwanncell培養(yǎng)液和成纖維細胞抑制液可以成功地在體外分離、收集，培養(yǎng)和增殖Schwanncelk但由于神經(jīng)細胞增殖速度較一般細胞慢，且傳代次數(shù)少，故難以在有限的傳代次數(shù)中(平均傳代15次)得到足夠量的Schwar

8、mcell用于坐骨神經(jīng)重建。 第三部分用粘附受體自身Schwanncell的同種畀體去細胞神經(jīng)支架重建坐骨神經(jīng) 方法：術(shù)前24小時測定5cm長坐骨神經(jīng)支架體積(n=30)并浸泡在4℃、1×PBS溶液中。術(shù)前20分鐘，將Schwanncell粘附到去細胞坐骨神經(jīng)支架上(n=20)。麻醉滿意后，在無菌操作下切除受體兔左側(cè)5cm長坐骨神經(jīng)后，用9-0可吸收縫線將粘附受體自身Schwarmcell的去細胞坐骨神經(jīng)支架(5cm長)

9、無張力地端端吻合于受體兔正常坐骨神經(jīng)近、遠兩端，吻合處用mNGF浸潤后縫合傷口。受體兔右側(cè)坐骨神經(jīng)作正常對照組(n=30)，單純移植去細胞神經(jīng)支架(n=10)作陰性對照組。 結(jié)果：移植術(shù)后6個月，單純移植去細胞神經(jīng)支架，移植粘附schwanncell的去細胞神經(jīng)支架與正常對照組比較發(fā)現(xiàn)： 1、單純移植去細胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細胞神經(jīng)支架的軸突數(shù)量分別為8900±1060和12000±980，與正

10、常對照組6800±740統(tǒng)計學(xué)檢驗，均有高度顯著性差異(P<0．01)，而移植不同去細胞支架之間的軸突數(shù)量經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗，也有高度顯著性差異(P<0．01)。 2、單純移植去細胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細胞神經(jīng)支架的神經(jīng)傳導(dǎo)速度分別為31．7±5．92m／s和47．22±4．89m／s，與正常對照組49．6±3．24m／s統(tǒng)計學(xué)檢驗，前者有高度顯著性差異(P<0．01)，后者無顯著性差異(P>0．05)。

11、 3、單純移植去細胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細胞神經(jīng)支架的肌力分別為175±8．6g和196±5．6g，與正常對照組200±6．8g統(tǒng)計學(xué)檢驗，前者有高度顯著性差異(P<0．01)，后者無顯著性差異(P>0．05)。 4、單純移植去細胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細胞神經(jīng)支架的溫度覺分別為67±5．1℃和66±3．8℃，與正常對照組65±2．7℃統(tǒng)計學(xué)檢驗，均無顯著性差異(P>0．05)。

12、 5、單純移植去細胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細胞神經(jīng)支架的痛覺分別為97．8±54％和984±3．8％，與正常對照組100±2％統(tǒng)計學(xué)檢驗，均無顯著性差異(P>0．05)。 結(jié)論： 1、移植術(shù)后6個月，單純移植去細胞神經(jīng)支架和移植粘附Schwanncell的去細胞神經(jīng)支架的軸突生長水平均較正常對照組高，有利于重建坐骨神經(jīng)的功能恢復(fù)；而移植粘附Schwanncell的去細胞神經(jīng)支架更有利于坐骨神經(jīng)