擬南芥T1N6_22基因抗灰霉病的分子機制研究.pdf

1、蔬菜灰霉病是由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）引起的一種極為嚴(yán)重的世界性病害。利用分子和基因工程的手段，發(fā)掘植物抗灰霉病的相關(guān)基因，繼而研究其抗病機制，以此培育蔬菜抗病品種，是非常重要和有效的途徑。本實驗室前期獲得了1株對灰葡萄孢敏感的擬南芥突變體，確定了其突變基因為T1N6_22，通過Real-Time PCR、RT-PCR技術(shù)和互補回復(fù)試驗，明確了T1N6_22為抗Bcinerea的正調(diào)控因子和抗PstDC3000（Ps

2、eudomonas syringae pv.tomato DC3000）的負(fù)調(diào)控因子，確定了其通過SA和JA兩條信號途徑來影響擬南芥的抗病性。本研究通過RT-PCR技術(shù)，確定了T1N6_22在不同組織部位和不同生長時期的表達(dá)規(guī)律;通過檢測T1N6_22與SA和JA途徑關(guān)鍵基因的雙突變體接種B.cinerea和Pst DC3000后，SA、JA途徑關(guān)鍵基因ICS1、PR1、JAR1及PDF1.2基因的表達(dá)情況，確定了T1N6_22基因與S

3、A和JA信號途徑的關(guān)系;利用GFP瞬時表達(dá)技術(shù)，確定了T1N6_22基因的亞細(xì)胞定位;利用GUS染色技術(shù)，確定了T1N6_22基因的組織定位;利用原核表達(dá)技術(shù)，獲得了純化的T1N6_22蛋白。研究結(jié)果為進(jìn)一步闡明T1N6_22基因在擬南芥抗灰霉病中的分子機制及抗病育種奠定了基礎(chǔ)。
　　1.利用RT-PCR技術(shù)，分析T1N6_22基因在擬南芥野生型的蓮座葉、莖生葉、花、種莢、莖和根中的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥野生型的蓮座葉、莖生葉

4、、花、莖和根中T1N6_22基因的表達(dá)水平比較相近，在花、莖和根的表達(dá)水平相對較高，在種莢中的表達(dá)水平最低。利用RT-PCR技術(shù)，檢測生長7d、14d、21d、28 d、35d的擬南芥野生型中T1N6_22基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擬南芥野生型在生長前3周，T1N6_22基因的表達(dá)水平呈上升趨勢，3周后下降，5周時表達(dá)水平明顯降低。
　　2.將t1n6_22突變體與SA、JA途徑關(guān)鍵基因突變體NahG、eds5和jar1進(jìn)行雜交，

5、獲得了雙突變體t1n6_22/NahG、t1n622/eds5和t1n6_22/jar1。對所獲得的雙突變體和野生型擬南芥接種灰葡萄孢B.cinerea和Pst DC3000后進(jìn)行抗病性分析，發(fā)現(xiàn)野生型擬南芥表現(xiàn)出典型的抗病反應(yīng)，雙突變體在接種后葉片出現(xiàn)水漬狀感病癥狀;利用RT-PCR技術(shù)，檢測接種灰葡萄孢的葉片中BcACTIN基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)雙突變體中的BcACTIN基因表達(dá)水平明顯高于野生型，表明雙突變體對灰葡萄孢的敏感性較野生

6、型明顯增強。將Pst DC3000接種于擬南芥野生型和雙突變體tln6_22/eds5、t1n622/NahG和t1n6_22/jar1發(fā)現(xiàn)，野生型與雙突變體t1n6_22/eds5、t1n6_22/NahG及t1n6_22/jar1均出現(xiàn)了葉片萎蔫卷曲等感病癥狀，接種葉片中cfu值測定結(jié)果顯示雙突變體對Pst DC3000的敏感性增強。
　　3.利用RT-PCR技術(shù)，檢測野生型擬南芥和雙突變體t1n6_22/jar1、t1n6_

7、22/eds5和t1n622/NahG接種灰葡萄孢后抗病相關(guān)基因JAR1、PDF1.2、ICS1和PR1的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)雙突變體t1 n6_22/jar1中JAR1基因一直呈下降趨勢，JA途徑的標(biāo)記基因PDF1.2在野生型中的表達(dá)水平略高于雙突變體，但差異不明顯，而t1n6_22/jar1中PDF1.2在48 h略有升高。表明，T1N6_22基因突變抑制了JA合成相關(guān)基因JAR1的表達(dá)，從而影響擬南芥對灰葡萄孢的抗性。利用RT-PCR技

8、術(shù)，檢測野生型擬南芥和雙突變體t1n6_22/jar1、t1n6_22/eds5和t1n6_22/NahG接種Pst DC3000后抗病相關(guān)基因JAR1、PDF1.2、ICS1及PR1的表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)ICSI在雙突變體t1n6_22/eds5體中有所上升，PR1有所上升，但均低于野生型水平;雙突變體t1n6_22/NahG中ICS1在0.5h迅速升高，隨后逐漸降低，PR1基因在2h時卻出現(xiàn)明顯升高，出現(xiàn)了SA積累，但隨后出現(xiàn)明顯下降，并

9、低于野生型水平，表明T1N6_22基因作為負(fù)調(diào)控因子影響植物體SA途徑，從而調(diào)節(jié)抗病防御反應(yīng)。
　　4.構(gòu)建了T1N6_22基因的亞細(xì)胞定位載體GFP-T1N6_22，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法，將GFP-T1N6_22載體轉(zhuǎn)化煙草，通過激光共聚焦顯微鏡觀察，確定了T1N6_22基因定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。
　　5.構(gòu)建了T1N622基因的組織定位載體T1N6_22pro∷GUS，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化擬南芥野生型，通過GUS組織

10、化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)其主要在下胚軸、根、葉片、花藥和萼片中均有表達(dá)。
　　6.構(gòu)建了T1N622基因的原核表達(dá)載體GST-T1N6_22，將其轉(zhuǎn)入原核表達(dá)菌株BL21種進(jìn)行體外誘導(dǎo)表達(dá)，確定了T1N6_22蛋白原核表達(dá)的最佳條件為IPTG0.1mmol/L，誘導(dǎo)時間為3h。通過GST親和純化方法，獲得了純化的T1N6_22蛋白。
　　7.成功構(gòu)建了T1N6_22基因融合FLAG標(biāo)簽的表達(dá)載體FLAG-T1N6_22，為后續(xù)ChIP