不同肢端畸形中HOXD13、TNNI2和TPM2基因的突變鑒定.pdf

1、先天性肢端畸形是人類最常見的出生缺陷之一，在新生兒中的發(fā)生率為1‰-2‰。引起先天性肢端畸形的原因有環(huán)境因素和遺傳因素兩大類。環(huán)境因素主要包括病毒感染、電離輻射、化學(xué)致畸劑、不良的子宮內(nèi)環(huán)境和母體的代謝性疾病等，例如，孕婦在妊娠早期服用反應(yīng)停所導(dǎo)致的海豹肢就是環(huán)境因素引起肢端畸形的典型示例。遺傳因素主要指基因突變或染色體畸變，其導(dǎo)致的肢端畸形既可單獨(dú)發(fā)生又可是某種綜合征的一部分。多種基因突變和染色體畸變都會(huì)直接引起肢端形態(tài)發(fā)生(morp

2、hogenesis)的異常，表現(xiàn)不同類型的肢端畸形，如并指(趾)、短指(趾)和缺指(趾)(ectrodactyly)畸形屬于形態(tài)發(fā)生不完全的結(jié)果，多指(趾)畸形則是形態(tài)發(fā)生過程中附加組織形成的結(jié)果。而以遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮畸形(distal arthrigryposis，DA)為代表的另一大類肢端畸形，其直接原因并不是形態(tài)發(fā)生的異常，而是關(guān)節(jié)、肌肉等功能缺陷的繼發(fā)表現(xiàn)。本文利用分別屬于上述兩大類肢端畸形的五個(gè)中國人家系為研究對(duì)象，進(jìn)行了致病基因

3、染色體定位、基因突變鑒定和突變基因功能初步分析等系列研究工作。 論文一 并指(趾)和短指(趾)畸形中日HOXD13基因突變研究 SD是由于指(趾)間骨性或軟組織融合形成的肢端畸形。BD是由于指(趾)骨和掌(跖)骨短小、缺失或融合導(dǎo)致的手足短小畸形。同樣，SD和BD既可單獨(dú)發(fā)生又可是某種綜合征的一部分。根據(jù)受累部位的解剖學(xué)特征，非綜合征型SD可分為Ⅰ-Ⅴ五種類型，非綜合征型BD被分為A-E五種類型。其中，BDA和BDE又可

4、分為若干亞型?，F(xiàn)已知，HOXD13和GJA1分別是Ⅱ型和Ⅲ型SD的致病基因。IHH、BMPR1B、ROR2和GDF5基因突變分別可致BDA1、BDA2、BDB和BDC。同時(shí)，攜帶GDF5基因突變的個(gè)體也可表現(xiàn)BDA2。HOXD13基因含2個(gè)外顯子，編碼蛋白包括335個(gè)氨基酸。其中，外顯子1編碼的蛋白N-端含一個(gè)由15個(gè)丙氨酸殘基組成的多聚丙氨酸(polyalanine)鏈，外顯子2編碼C-端的同源異形結(jié)構(gòu)域(homeodomain,HD

5、)。Ⅱ型SD又稱并多指(趾)(synpolydactyly，SPD)，由HOXD13基因多聚丙氨酸延展(polyalanine expansion，PAE)等突變引起。HOXD13基因點(diǎn)突變引起HD內(nèi)氨基酸替代時(shí)可導(dǎo)致BDD和BDE。因此，HOXD13單一基因內(nèi)不同突變可以是不同類型肢端畸形發(fā)生的遺傳基礎(chǔ)。本文在三個(gè)肢端畸形大家系進(jìn)行了HOXD13基因致病基因的鑒定研究。 家系1中患者手部畸形特征表現(xiàn)為4-5掌骨融合，其它主要表

6、現(xiàn)為2-5指尺側(cè)偏位及遠(yuǎn)節(jié)指骨短小、3-4或4-5并指、第5指短小或彎曲、屈指和中遠(yuǎn)指節(jié)間關(guān)節(jié)褶消失；足部畸形共同表現(xiàn)為：趾骨外翻，跖骨內(nèi)翻，第1趾(跖)骨粗大，第2-5趾 (跖)骨發(fā)育不良，第5趾(跖)骨短。以上手足畸形表型與Robinow等報(bào)道的V型SD一致。家系2中患者畸形僅限于手足，手足骨骼普遍都縮短，屬于兼有BDA4，BDD和BDE表型的復(fù)合型BD。突出的表現(xiàn)是全部患者雙足2-5趾中節(jié)趾骨缺失，雙手2-5指中節(jié)指骨短小或與遠(yuǎn)節(jié)

7、指骨融合，但以第5指、第2和5指中節(jié)指骨受累最多。部分患者拇指遠(yuǎn)節(jié)指骨粗短；3-5掌(跖)骨全部或部分短小畸形；拇趾粗大、趾骨寬短；3-4指或2-3趾間軟組織輕度并指(趾)。家系3為一典型的SPD家系，患者主要臨床表現(xiàn)為3-4并指及4-5并趾，蹼中的第4指及第5趾部分或完全多指(趾)。 首先在染色體2q24.3-q31.3區(qū)段HOXD13基因內(nèi)部及基因兩側(cè)選取6個(gè)多態(tài)信息量高的微衛(wèi)星標(biāo)記，采用LNKAGE軟件包中的MLINK程序

8、計(jì)算遺傳標(biāo)記與致病基因所在的疾病基因座(disease locus)間的LOD值，對(duì)家系1進(jìn)行兩點(diǎn)連鎖分析。結(jié)果表明：致病基因與上述微衛(wèi)星標(biāo)記存在緊密連鎖關(guān)系，在D2S23 14標(biāo)記獲得最大LOD值，為4.90(θ=0.00)。單體型分析顯示：家系1中SD表型與5個(gè)標(biāo)記(D2S2981、HOXD13、D2S2314、D2S324和D2S1391)共分離。我們前期對(duì)家系2進(jìn)行的兩點(diǎn)連鎖和單體型分析，己得到BD表型與3個(gè)標(biāo)記(D2S2981

9、、HOXD13和D2S2314)共分離的數(shù)據(jù)資料。在此基礎(chǔ)上，我們通過PCR擴(kuò)增HOXD13基因外顯子及外顯子／內(nèi)含子交界區(qū)，PCR產(chǎn)物直接測(cè)序或克隆測(cè)序，在上述三個(gè)家系中進(jìn)行了致病基因突變鑒定研究。結(jié)果表明：三個(gè)家系中不同肢端畸形都由HOXD13基因的雜合突變所致。其中，V型SD家系中致病突變?yōu)閏.950A>G(p.Gln317Arg)，突變導(dǎo)致HOXD13蛋白HD內(nèi)第50位氨基酸由谷氨酰胺(Gin)變?yōu)榫彼?Arg)；復(fù)合型BD家

10、系中致病突變?yōu)閏.160 180delGCGGCGGCTGCGGCGGCGGCG(p．Ala54_Ala60del)，突變導(dǎo)致HOXD13蛋白7個(gè)丙氨酸(Ala)缺失，為多聚丙氨酸縮短(polyalanine contraction，PAC)；SPD家系中致病突變?yōu)閏．1 72_ 198dupGCGGCGGCGGCGGCAGCGGCGGCTGCG(p．Ala58-Ala66dup)，導(dǎo)致HOXD13蛋白9個(gè)Ala重復(fù)，屬于常見的PAE。

11、通過PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析或／和PAGE分析驗(yàn)證上述三種HOXD13基因突變，發(fā)現(xiàn)在相應(yīng)的家系中突變見于全部患者而未見于正常家系成員。在100名和124名無關(guān)正常個(gè)體中分別檢測(cè)p．Gln317Arg和p.Ala54_Ala6Odel突變，結(jié)果均為陰性。特別值得提及的是，HOXD13蛋白第317位Gln是其結(jié)合DNA的關(guān)鍵氨基酸之一，迄今為止已知的HOX蛋白家族全部成員在HD第50位氨基酸都是Gin。以上結(jié)果和數(shù)據(jù)強(qiáng)烈提示，p．Gln

12、317Arg和p.Ala54_Ala6Odel兩種突變?yōu)橹虏⊥蛔?。通過單體型分析和突變直接檢測(cè)，在家系1和3中分別完成了1例和2例高危胎兒的產(chǎn)前診斷。 總之，通過上述研究，我們發(fā)現(xiàn)了V型SD的致病基因，首次證明HOXD13基因PAC突變能引起B(yǎng)DA4／BDE／BDE畸形，首次在中國人SPD家系中檢測(cè)到HOXD13基因PAE突變。我們的研究結(jié)果為HOXD13基因突變相關(guān)肢端畸形表型譜增添了新的內(nèi)容。 論文二遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮畸形

13、中TNN13和TPM2基因突變研究 源于肌肉和關(guān)節(jié)等功能缺陷的先天性肢端畸形以遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)攣縮畸形(distalarthrogryposis，DA)最為常見，在新生兒中的發(fā)生率約為1／3000。DA患者主要臨床表現(xiàn)為對(duì)稱性或非對(duì)稱性的疊指、屈指、2-5指尺側(cè)偏位；馬蹄內(nèi)翻足、垂直距骨和扁平足等畸形。此外，DA還可伴隨顏面、身高、脊柱和皮膚紋理等異常。根據(jù)有無顏面等畸形，DA可分成10種亞型。其中，DA1為單純的手足關(guān)節(jié)攣縮畸形；DA2

14、A除手足關(guān)節(jié)攣縮畸形外還兼有微小嘴、“H”形頰窩、鼻唇褶明顯、人中長、小鼻子、瞼裂狹小、眼距寬大伴眼睛深陷和脊柱側(cè)凸等；DA2B表型介于DAl和DA2A之間，除手足關(guān)節(jié)攣縮畸形外，可有三角臉、瞼裂下斜和小嘴等顏面部表現(xiàn)。國外研究表明，編碼快速收縮肌纖維蛋白的三個(gè)基因TPM2(定位于染色體9p13)和TNNl2/TNNT3(定位于染色體11p15)的點(diǎn)突變可分別導(dǎo)致：DAl和DA2B。我們收集到兩個(gè)符合DA2B診斷標(biāo)準(zhǔn)的DA家系并進(jìn)行了致

15、病基因突變鑒定研究。家系1為七代，包括32名患者，具有DA2B的典型手足和顏面表現(xiàn)，但家系內(nèi)患者表型變異明顯，3名患者有脊柱側(cè)凸(其中2名伴先天性髖脫位)。家系2三代共3名患者，1名患者有DA2B的典型的手足和顏面表現(xiàn)，其余2名患者僅有手足關(guān)節(jié)攣縮畸形，全部患者都表現(xiàn)身材矮小。我們首先通過UCSC人類基因組數(shù)據(jù)庫，在候選基因TPM2、TNNl2/TNNT3和TNNC2附近選擇微衛(wèi)星序列9p13AAC、llpl5CCT、11p15GI、和

16、20q13AC，自行設(shè)計(jì)PCR引物在家系中進(jìn)行兩點(diǎn)連鎖分析和等位基因共享分析。在家系1中，11p15CCT顯示最大LOD值，在θ=O時(shí)為3.91，9p13AAC和20q13AC的LOD值在θ=O時(shí)都為-∞；在家系2中，僅9p13AAC存在等位基因共享，呈正LOD值(θ=O時(shí)為0.91)。以上結(jié)果提示：家系1中致病基因可能為TNNl2或TNNT3；家系2中致病基因可能為TPM2,，進(jìn)一步在家系1中進(jìn)行TNNl2基因編碼區(qū)的PCR擴(kuò)增和測(cè)序

17、，發(fā)現(xiàn)一個(gè)涉及三個(gè)堿基的微小缺失突變，即c.523-525delAAG。該突變導(dǎo)致肌鈣蛋白I的175位賴氨酸缺失(p.Lysl75del)。家系中全部患者都攜帶此突變，而在正常家系成員和50名無關(guān)正常對(duì)照個(gè)體中都未檢測(cè)到此突變。通過NCBI/BLAST進(jìn)行同源序列比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)175位賴氨酸為所有肌鈣蛋白I中高度保守的氨基酸。因此，我們認(rèn)為c.523-525delAAG(p.Lysl75del)為致病突變。在家系2中進(jìn)行TPM2基因測(cè)序

18、，發(fā)現(xiàn)所有患者為c.308A>G(p.Glnl03Arg)錯(cuò)義突變的雜合子。通過PCR產(chǎn)物限制性內(nèi)切酶分析驗(yàn)證，確認(rèn)正常家系成員和65名無關(guān)正常對(duì)照個(gè)體中均無此突變。同樣，TPM2基因c.308A>G(p.Glnl03Arg)突變改變了β-原肌球蛋白中高度保守的氨基酸。所以，該突變也應(yīng)該為致病突變。 綜上所述，我們首次在中國人DA2B家系中檢出TNNl2基因致病突變，發(fā)現(xiàn)TPM2基因突變亦導(dǎo)致DA2B。本文在中國人DA2B家系中