DNA條形碼COI序列在肉類鑒別中的應(yīng)用研究.pdf

1、市場中銷售的動物源性食品，通過摻雜、摻假等手段欺騙消費(fèi)者而牟取暴利的事件屢屢出現(xiàn)。為了對市場上的動物源性食品進(jìn)行摻假鑒定，判別與產(chǎn)品標(biāo)簽是否相符，本研究通過DNA條形碼技術(shù)鑒別肉類及其制品，建立基于DAN條形碼技術(shù)的鑒別方法。
　　1.通過提取牛、羊、豬、雞、鴨、兔、鼠、狗、狐、貉、馬、驢12個(gè)物種的基因組DNA為模板，利用14對引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序比對（其中8對引物根據(jù)12個(gè)物種基因的保守序列設(shè)計(jì)，6對引物來源于參考文獻(xiàn)和數(shù)

2、據(jù)庫），建立12種動物源性食品DNA條形碼鑒別技術(shù)。篩選出通用引物COI-4和COI-14為較優(yōu)序列，其中引物COI-4在除兔肉和驢肉外的10個(gè)物種中擴(kuò)增效率100％，引物COI-14在除狗肉外的11個(gè)物種中擴(kuò)增效率100％，兩對引物組合可對12種肉進(jìn)行檢測。
　　2.通過定量提取生鮮牛肉、羊肉、豬肉和鴨肉基因組DNA，按一定比例進(jìn)行預(yù)混合，構(gòu)建牛肉摻豬肉、羊肉摻豬肉、牛肉摻鴨肉和羊肉摻鴨肉4種摻假模型。通過引物COI-4和COI

3、-14進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測序比對，建立基于COI基因的動物源性食品的摻假判別方法。根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得純?nèi)釪NA提取率T實(shí)現(xiàn)DNA水平到肉水平摻假比例的換算。通過引物COI-4，在DNA水平上對牛-豬、羊-豬、牛-鴨和羊-鴨模型的檢出限分別可以達(dá)到40％、10％、50％和50％，在肉水平上對牛-豬、羊-豬、牛-鴨和羊-鴨模型的檢出限分別可以達(dá)到40％、15％、19％和28％;通過引物COI-14，在DNA水平上對牛-豬、羊-豬和牛-鴨模型的檢出限

4、可以達(dá)到5％，羊-鴨的模型的檢出限可以達(dá)到10％，在肉水平上牛-豬、羊-豬、牛-鴨和羊-鴨模型的檢出限分別可以達(dá)到5％、8％、1％和4％。
　　3.通過建立的DNA條形碼技術(shù)鑒別方法對市售的動物源性食品主要為摻假嚴(yán)重的牛羊肉食品進(jìn)行鑒定，判斷與所貼標(biāo)簽是否相符。本研究成功對83批次的動物源制品完成檢測及判定，89％的樣品與產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識的成分相符。其中牛肉制品，84％的樣品與產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識的成分相符;羊肉制品，84％的樣品與產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)

5、識的成分相符;驢肉制品，83％的樣品與產(chǎn)品標(biāo)簽標(biāo)識的成分相符，其他的肉制品未出現(xiàn)摻假和標(biāo)簽不符現(xiàn)象。
　　4.為實(shí)現(xiàn)快速檢測，本研究通過引物COI-14進(jìn)行擴(kuò)增，采用AluI和HinfI兩種限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，建立PCR-RFLP鑒別技術(shù)。四種肉的PCR產(chǎn)物通過內(nèi)切酶AluI，牛肉的PCR產(chǎn)物被酶切成188bp和533bp兩個(gè)片段;羊肉的PCR產(chǎn)物被酶切成26bp、227bp和468bp三個(gè)片段;豬肉的PCR產(chǎn)物被酶切成129b

6、p、348bp和373bp三個(gè)片段;鴨肉的PCR產(chǎn)物被酶切成306bp和415bp兩個(gè)片段，四種肉可以通過酶切清晰的分辨出來。四種肉的PCR產(chǎn)物通過內(nèi)切酶HinfI，牛肉的PCR產(chǎn)物被酶切成259bp和462bp兩個(gè)片段;羊肉的PCR產(chǎn)物被酶切成56bp、181bp和514bp三個(gè)片段;豬肉的PCR產(chǎn)物被酶切成193bp、240bp和288bp三個(gè)片段;鴨肉的PCR產(chǎn)物被酶切成356bp和363bp三個(gè)片段，四種肉可以通過酶切清晰的分辨