貝類(lèi)DNA條形碼的篩選、驗(yàn)證及應(yīng)用.pdf

1、貝類(lèi)種類(lèi)繁多，分布范圍廣泛，棲息環(huán)境多種多樣，外部的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理解剖特點(diǎn)可以作為其分類(lèi)的依據(jù)。然而，由于環(huán)境的變化，這些外部的分類(lèi)特征具有極大的可塑性，這就給傳統(tǒng)的利用形態(tài)特征對(duì)貝類(lèi)進(jìn)行分類(lèi)鑒定帶來(lái)了諸多困難。
　　DNA條形碼技術(shù)（DNA barcoding）是利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)物種進(jìn)行分類(lèi)的方法，主要是通過(guò)PCR擴(kuò)增和測(cè)序獲得一段標(biāo)準(zhǔn)同源序列，再將該序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和聚類(lèi)分析，從而將某一個(gè)物種準(zhǔn)確地歸為某一特定類(lèi)群中

2、的分類(lèi)鑒定技術(shù)。雖然關(guān)于COI、12S、16S、18S和28S等基因作為DNA條形碼的研究已有很多，但對(duì)條形碼數(shù)據(jù)分析總結(jié)的研究依然很少，本研究挑選了具有代表性的新腹足目、簾蛤目、貽貝目和珍珠貝目的種類(lèi)進(jìn)行條形碼數(shù)據(jù)分析，從而使實(shí)現(xiàn)條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因的篩選驗(yàn)證，以便應(yīng)用。
　　首先，通過(guò)對(duì)新腹足目、簾蛤目、貽貝目、和珍珠貝目的COI、16S、18S和28S基因部分序列的分析，進(jìn)行DNA條形碼標(biāo)準(zhǔn)基因的篩選。基于COI基因的序列分析發(fā)現(xiàn)

3、，科間差異在基本集中在30％-70%之間，屬間差異集中在20%-50%之間，種內(nèi)差異集中在0.0%-7.5%之間，說(shuō)明COI基因可以區(qū)到不同科、不同屬、甚至是同一物種，作為貝類(lèi)DNA條形碼具有可行性?；?6S基因的部分序列我們發(fā)現(xiàn)，科間差異在35%-70%，屬間差異在10%-45%，種內(nèi)差異在0.2%-1.5%之間，和COI基因一樣，16S也可以用來(lái)作為DNA條形碼來(lái)鑒別分類(lèi)。而在18S和28S基因部分序列中，科間差異集中在10%-5

4、0%，屬間差異5%-15%，種內(nèi)差異基本為0。由此可見(jiàn)，18S和28S基因在區(qū)分近緣物種方面不具優(yōu)勢(shì)，只適合作為高的分類(lèi)階元的分子標(biāo)記。
　　其次，收集了青島、煙臺(tái)、大連、海口、廈門(mén)和寧波等地貝類(lèi)，提取基因組DNA后，分別利用COI和16S通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得COI和16S基因的部分序列，然后對(duì)序列進(jìn)行遺傳多樣性分析。結(jié)果表明，共擴(kuò)增出74條COI序列，其長(zhǎng)度經(jīng)剪切為578 bp，平均種間遺傳距離為0.958，種間的遺傳距

5、離大于種內(nèi)的遺傳距離，構(gòu)建的進(jìn)化樹(shù)表明，所獲取的貝類(lèi)明顯分為兩支，不同地理群體的同一物種首先明顯聚在一起，同一目的物種再聚在一起，所篩選的COI序列能夠?qū)⒈狙芯恐械奈锓N全部區(qū)分開(kāi)來(lái)。一共獲得68條不同貝類(lèi)的16S部分序列，經(jīng)剪切之后，長(zhǎng)度均為421bp，平均種間遺傳距離為0.633。同COI序列的分析結(jié)果一樣，16S進(jìn)化樹(shù)也可已將本研究中的大部分物種區(qū)分開(kāi)來(lái)，雖然也分為明顯的兩支，但習(xí)見(jiàn)蛙螺（Bursa rana）和圓頂珠蚌（Unio

6、douglasiae）聚為一支，也不能區(qū)分開(kāi)Solen lamarckii和Meretrix meretrix，說(shuō)明16S在物種鑒別方面仍有一定的局限性。本研究結(jié)果表明，COI和16S均可以作為DNA條形碼來(lái)區(qū)分和鑒別物種。
　　最后，采用PCR技術(shù)，擴(kuò)增了中國(guó)膠南、長(zhǎng)島、蓬萊、榮成和韓國(guó)統(tǒng)營(yíng)五個(gè)地理群體魁蚶樣本的COI、12S、18S和28S基因部分序列，并分析了五個(gè)魁蚶地理群體的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。經(jīng)測(cè)序比對(duì)分析，分別獲

7、得67條776 bp的COI序列、72條443bp的12S序列、75條909 bp的18S序列和75條894bp的28S序列。序列比對(duì)結(jié)果表明，五個(gè)群體75個(gè)個(gè)體的COI序列中共檢測(cè)到521個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，39種單倍型，單倍型多樣度為0.979，核苷酸多樣度為0.05632；12S序列中共檢測(cè)到292個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，43種單倍型；在18S序列中，五個(gè)群體都表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性，共有74種單倍型，膠南群體多態(tài)位點(diǎn)有488個(gè)，平均核苷酸差異指數(shù)是