塵肺病相關(guān)基因篩選研究.pdf

1、塵肺病是目前我國(guó)職業(yè)病中發(fā)病率最高、死亡危險(xiǎn)性較大、對(duì)勞動(dòng)者危害最嚴(yán)重的一類(lèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)目前我國(guó)塵肺病例約占職業(yè)病患者總?cè)藬?shù)的近三分之二。塵肺發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，迄今為止尚難以圓滿解釋其發(fā)生過(guò)程，對(duì)其發(fā)生發(fā)展起關(guān)鍵作用的分子尚不清楚，也缺乏對(duì)其根治或阻止進(jìn)展的方法。以往研究表明，塵肺病的發(fā)生、發(fā)展是復(fù)雜的多階段過(guò)程，其中有眾多細(xì)胞和分子的參與及相互作用，因而有可能涉及眾多基因的表達(dá)活動(dòng)。相關(guān)基因在塵肺病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有不同的作用，但在時(shí)間

2、和空間上又可能相互協(xié)調(diào)構(gòu)成一個(gè)整體，成為決定塵肺病發(fā)生、發(fā)展的重要影響因素之一。因此利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段進(jìn)一步細(xì)致觀察塵肺病發(fā)生、發(fā)展的過(guò)程，特別是將眾多的塵肺病相關(guān)基因作為一個(gè)“基因群”(genecluster)進(jìn)行研究，篩選出在塵肺病多個(gè)環(huán)節(jié)上具有調(diào)控作用的關(guān)鍵基因，揭示塵肺病發(fā)生、發(fā)展在基因水平的本質(zhì)，對(duì)于深入研究其分子機(jī)制及探索健康監(jiān)護(hù)措施、早期診斷方法乃至新的治療手段都具有重要的意義。 此研究以SD大鼠氣管灌注石英粉

3、塵制作矽肺模型，首次采用基因芯片技術(shù)對(duì)早期矽肺組織和正常肺組織基因表達(dá)譜進(jìn)行比較研究，首次采用熒光標(biāo)記mRNA差異顯示技術(shù)對(duì)早期矽肺組織中與正常肺組織差異表達(dá)的部分基因進(jìn)行克隆與鑒定，以初步探討矽肺發(fā)病基因水平的分子變化、篩選與矽肺發(fā)生相關(guān)的基因，期望為今后深入研究和闡明塵肺病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程的分子機(jī)制及確認(rèn)塵肺病的關(guān)鍵性調(diào)控基因提供基礎(chǔ)資料，并為進(jìn)一步深入研究塵肺病健康監(jiān)護(hù)措施、早期診斷方法和新的治療手段提供相關(guān)理論依據(jù)。另外，首次通過(guò)

4、對(duì)中國(guó)河南省漢族煤工塵肺患者和煤塵接觸者的TGF-β1基因-509位點(diǎn)多態(tài)性的檢測(cè)，初步探討其在煤工塵肺發(fā)病中的可能作用，期望對(duì)于闡明基因多態(tài)性與煤工塵肺等塵肺病的遺傳易感性關(guān)系提供相關(guān)線索和參考依據(jù)。 一、利用基因芯片技術(shù)篩選矽肺相關(guān)基因研究基因芯片是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。其原理是將高密度特定的寡核苷酸片段或基因片段陣列作為探針，通過(guò)高速機(jī)器人或原位合成方式以一定的順序或排列方式使其附著在玻璃片等固相表面上，然后與待測(cè)的

5、標(biāo)記樣品的基因按堿基配對(duì)原理進(jìn)行雜交，再通過(guò)激光共聚焦熒光檢測(cè)系統(tǒng)等對(duì)芯片進(jìn)行掃描，并配以計(jì)算機(jī)系統(tǒng)對(duì)每一探針上的熒光信號(hào)做出比較和檢測(cè)，從而迅速得出相關(guān)的信息?；蛐酒瑸檠芯扛鞣N疾病發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中的基因表達(dá)譜和關(guān)鍵性基因提供了強(qiáng)有力的工具。 此課題以SD大鼠氣管灌注石英粉塵制作矽肺模型，采用Qiagen公司的共有5705條大鼠基因的基因芯片，首次對(duì)早期矽肺組織和正常肺組織基因表達(dá)譜進(jìn)行比較分析研究，篩選出在早期矽肺組織樣品與

6、正常肺組織樣品相比差異表達(dá)明顯的基因共323個(gè)(包括尚未在GenBank登錄的大鼠全長(zhǎng)新基因49個(gè))，其中上調(diào)基因109個(gè)、下調(diào)基因214個(gè)。提示矽肺發(fā)生可能導(dǎo)致組織細(xì)胞功能簡(jiǎn)化，且有大量未知基因需要深入研究。這些差異表達(dá)的基因涉及參與細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、應(yīng)激反應(yīng)、代謝酶、發(fā)育、細(xì)胞構(gòu)建與發(fā)生、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、分化、細(xì)胞周期、細(xì)胞粘連、細(xì)胞凋亡等重要生命活動(dòng)的基因及原癌基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果為塵肺病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中氧化損傷、“鈣超載”損害巨噬

7、細(xì)胞、細(xì)胞因子作用的存在及免疫反應(yīng)的參與等提供了基因水平的證據(jù)和相關(guān)線索。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還提示，原癌基因和抑癌基因在塵肺病發(fā)生過(guò)程中的作用及規(guī)律、信號(hào)網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)參與調(diào)控塵肺發(fā)生過(guò)程中的相關(guān)基因表達(dá)規(guī)律、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及熱休克蛋白等在塵肺中的意義均值得進(jìn)一步探討。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，基因芯片技術(shù)在探討塵肺病發(fā)生、發(fā)展的基因水平的分子機(jī)制、篩選塵肺病相關(guān)基因及進(jìn)一步深入研究塵肺病健康監(jiān)護(hù)措施、早期診斷方法和新的治療手段等方面有著廣闊的應(yīng)用前景。

8、 二、mRNA差異顯示法篩選矽肺相關(guān)基因研究mRNA差異顯示(mRNADD)技術(shù)可比較不同類(lèi)型組織(細(xì)胞)或相同類(lèi)型組織(細(xì)胞)在不同條件下mRNA水平的差異，是以PCR和聚丙烯酞胺凝膠電泳為基礎(chǔ)的技術(shù)，也是目前常用篩選差異表達(dá)基因的方法之一。它利用真核細(xì)胞mRNA3’端具有的多聚核昔酸尾Ploy(A)，用錨定引物(T12MN(M=A/C/G，N=A/C/G/T)與mRNA的Ploy(A)尾結(jié)合并錨定緊靠Ploy(A)的兩個(gè)堿基，在反轉(zhuǎn)

9、錄酶作用下啟動(dòng)mRNA群體反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以原3’端錨定引物和5’端的隨機(jī)引物所構(gòu)成的引物對(duì)對(duì)全部cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增結(jié)果中的每一條帶則代表一種特定mRNA，回收差異條帶、再擴(kuò)增之后可進(jìn)行克隆鑒定和比較分析。 此課題以SD大鼠氣管灌注石英粉塵制作矽肺模型，首次采用熒光標(biāo)記的mRNA差異顯示(FDD)技術(shù)對(duì)早期矽肺組織和正常肺組織基因的mRNA差異進(jìn)行分析，結(jié)果篩選出在早期矽肺組織樣品中表達(dá)明顯而在正常肺組織樣品中不

10、表達(dá)或表達(dá)極少的基因10個(gè)。選擇其中的4個(gè)進(jìn)行了克隆、測(cè)序并與GenBank進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中一條為編碼載脂蛋白F(ApoF)的基因，另外3條為未知功能的新序列。對(duì)ApoF的研究至今仍然很少，其功能尚不清楚，它在矽肺發(fā)病中的作用更是未見(jiàn)報(bào)道。因此，尚需進(jìn)一步研究ApoF與矽肺發(fā)病的關(guān)系，并需運(yùn)用基因功能分析技術(shù)對(duì)另外3條未知功能的新基因進(jìn)行系統(tǒng)研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，mRNA差異顯示技術(shù)作為快速、有效、經(jīng)濟(jì)的篩選新的功能基因的手段，同樣

11、適用于篩選塵肺病相關(guān)基因。 三、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1基因多態(tài)性與煤工塵肺關(guān)系研究目前國(guó)內(nèi)外研究者認(rèn)為多種細(xì)胞因子在肺纖維化形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，其中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1的作用尤其受到重視。TGF-β1可能通過(guò)上調(diào)膠原和纖維粘連蛋白基因表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的增多，并可能通過(guò)降低蛋白酶分泌和增加蛋白酶抑制劑的分泌抑制基質(zhì)的降解，從而參與肺組織的纖維化過(guò)程。研究資料提示TGF-β1基因-509位點(diǎn)存在多態(tài)性，其基因型與TGF-β1蛋白的分泌

12、密切相關(guān)：C/T、T/T基因型可能為高分泌型，C/C基因型則可能為低分泌型。 此課題首次利用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)中國(guó)河南省漢族煤工塵肺患者109例和煤塵接觸者110例的TGF-β1基因-509位點(diǎn)的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)，并用TGF-β1ELISA試劑盒檢測(cè)了67例塵肺病患者的血清TGF-β1濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TGF-β1基因-509位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)中國(guó)河南省漢族煤工塵肺發(fā)病的遺傳易感性可能起重要作用，證實(shí)TGF-β1基因-509位點(diǎn)C