Linker插入的乙肝病毒靶向核糖核酸酶的構(gòu)建及其抗病毒活性的研究.pdf

1、HBV感染是當(dāng)今最嚴(yán)重的健康問題之一,常會(huì)引起慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌.為了更好的觀察和證實(shí)我們構(gòu)建的乙肝病毒靶向核糖核酸酶在體內(nèi)的作用,該實(shí)驗(yàn)換用重組腺病毒載體RAd為后續(xù)的體內(nèi)試驗(yàn)及功能研究打下基礎(chǔ).首先構(gòu)建帶目的片段的腺病毒穿梭質(zhì)粒,將各目的片段TR-L、TR、TRmut、HBVc、hEDN,克隆入腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC316.在293細(xì)胞中包裝形成含目的片段重組腺病毒、鑒定、擴(kuò)增及滴度測定.獲得的各病毒滴度分別為(10<'7>pf

2、u/m1):RAd/TR-L:4.1;RAd/TR:4.5:RAd/TRmut:3.7;RAd/hEDN:5.6;RAd/HBVc:6.3;RAd/空:5.7.用獲得的重組腺病毒感染2.2.15細(xì)胞后,IFA顯示,感染RAd/TR-L的2.2.15細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)綠色熒光,說明RAd/TR-L在2.2.15細(xì)胞內(nèi)有表達(dá).以重組腺病毒分別感染2.2.15細(xì)胞,同時(shí)設(shè)立空感染為全陰性對照,48小時(shí)后提取細(xì)胞上清,應(yīng)用RIA測定HBsAg、HBe

3、Ag含量顯示,RAd/TR-L及RAd/TR細(xì)胞上清中HBsAg、HBeAg的濃度與其它對照組相比有明顯下降(P<0.01),各對照組濃度差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);TR-L組與TR組相比有差異(P<0.05).TR-L組與空感染組相比,上清中HBsAg、HBeAg的濃度分別下降了65.3％、62.7%.熒光定量PCR法測定上清HBV-DNA含量:TR-L組與TR組細(xì)胞上清中HBV-DNA的含量與對照組相比有明顯下降(P<0.0

4、1),各對照組含量差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);TR-L組與TR組相比有差異(P<0.05).TR-L組與空感染組相比,濃度下降了59.9%.各組細(xì)胞感染后觀察形態(tài)與感染前無差別,MTT比色分析顯示,各組間差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說明細(xì)胞增殖未受抑制.以上結(jié)果表明,linker的插入可能通過優(yōu)化HBVc和hEDN分子之間的空間構(gòu)象降低其空間位阻而增強(qiáng)TR的抗HBV效率.盡管諸多實(shí)驗(yàn)條件如細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、細(xì)胞代數(shù)等不同,但從TR-L真