Nifedipine調(diào)節(jié)白皮松(Pinus bungeana)花粉管蛋白質(zhì)表達(dá)及其對(duì)細(xì)胞壁構(gòu)建的影響.pdf

1、花粉管是種子植物受精過程中的雄性生殖單位的載體，由于其生長(zhǎng)依賴于胞內(nèi)Ca2+梯度，并具有典型的頂端極性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，因而成為近年來(lái)研究植物細(xì)胞相互識(shí)別、胞內(nèi)和胞外信號(hào)傳導(dǎo)理想的模式系統(tǒng)。裸子植物花粉與被子植物相比具有萌發(fā)時(shí)間長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢等特點(diǎn)。Ca2+在裸子植物花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)中的作用機(jī)制目前尚不明確。本研究以裸子植物白皮松(Pinus bungeana)的花粉為材料，運(yùn)用不同濃度鈣通道抑制劑Nifedipine(Nif)處理，對(duì)其花

2、粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)研究和蛋白質(zhì)組學(xué)分析，以探討Ca2+對(duì)白皮松花粉生長(zhǎng)的調(diào)控機(jī)制，為進(jìn)一步揭示裸子植物花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)機(jī)理提供參考。
　　 本論文首先研究了鈣通道抑制劑Nif和Ca2+螯合劑EGTA對(duì)白皮松花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明，用Nif處理花粉后，花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)均受到明顯抑制。經(jīng)Ca2+熒光探針Fluo-3AM標(biāo)記，對(duì)Nif處理后Ca2+在花粉管中的分布模式進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)Ca2+在正常生長(zhǎng)

3、的花粉管中呈梯度分布，并在其頂端的熒光最強(qiáng)。與對(duì)照相比，處理后的花粉管熒光強(qiáng)度明顯減弱，且頂端Ca2+梯度消失。通過EGTA漂洗后的花粉粒，在正常培養(yǎng)基上萌發(fā)率較高，但其生長(zhǎng)速率受到抑制。由此說明了細(xì)胞壁鈣庫(kù)對(duì)花粉管生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)顯著高于對(duì)花粉萌發(fā)的影響，是花粉管生長(zhǎng)的限速因子。同時(shí)外加鈣調(diào)素還可逆轉(zhuǎn)EGTA對(duì)其花粉萌發(fā)和花粉管生長(zhǎng)的抑制。上述結(jié)果表明，白皮松花粉萌發(fā)及花粉管生長(zhǎng)需要外源Ca2+的內(nèi)流，以及胞內(nèi)形成的Ca2+濃度梯度。<

4、br>　　 用FM4-64探針標(biāo)記結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正?；ǚ酃苤械陌套饔弥饕l(fā)生在頂端和亞頂端區(qū)域，胞吞的小泡也集中分布在這兩個(gè)區(qū)域。經(jīng)Nif處理后，既不影響花粉管的胞吞過程，同時(shí)胞吞發(fā)生的位置也與對(duì)照相似，只是胞吞的小泡分散于整個(gè)花粉管中。電子顯微鏡觀察表明，各種細(xì)胞器在白皮松正常生長(zhǎng)的花粉管中分布與被子植物存在較大差異，例如前者無(wú)明顯地分區(qū)現(xiàn)象，不具胼胝質(zhì)塞。白皮松花粉管頂端和亞項(xiàng)端的壁旁體與質(zhì)膜融合現(xiàn)象頻繁發(fā)生。花粉管經(jīng)Nif處理后，

5、線粒體出現(xiàn)不同程度的解體和液泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)液泡化和核糖體脫落，液泡大量聚集在花粉管頂端，壁旁體與膜融合現(xiàn)象減少，以及花粉管壁明顯變薄等。此外，通過微絲特異性探針鬼筆環(huán)肽標(biāo)記結(jié)果表明，正常生長(zhǎng)花粉管的微絲呈長(zhǎng)軸向排列， Nif處理后微絲斷裂，其斷裂程度與處理濃度有關(guān)。由此可見，外源Ca2+對(duì)花粉管的胞吞無(wú)明顯抑制或促進(jìn)作用，但對(duì)胞吞小泡重回收可能有影響。當(dāng)胞內(nèi)Ca2+梯度消失后，則明顯抑制了微絲骨架的聚合，進(jìn)而使胞吐作用減緩，高爾基體分泌小

6、泡聚集，多種細(xì)胞器液泡化，引起花粉管頂端膨大，細(xì)胞壁變薄，繼而抑制花粉管的正常生長(zhǎng)。
　　 運(yùn)用免疫熒光標(biāo)記技術(shù)顯示，正常生長(zhǎng)的花粉管壁含有纖維素、胼胝質(zhì)、果膠質(zhì)和阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGPs)，其中纖維素和胼胝質(zhì)在細(xì)胞壁上呈均勻分布，而酸性果膠質(zhì)只存在花粉管兩側(cè)壁上，酯化果膠分布于花粉管頂端。經(jīng)過Nif處理后，胼胝質(zhì)和酸性果膠質(zhì)均在花粉管頂端累積，而AGPs和纖維素的分布卻無(wú)明顯變化。另外，傅里葉紅外光譜分析結(jié)果也同樣支持上述

7、結(jié)論。通過花粉管壁蛋白的SDS-PAGE分析表明，Nif對(duì)細(xì)胞壁蛋白的合成也有較大的影響。
　　 在花粉管的鈣通道受到抑制后，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分析其蛋白質(zhì)的表達(dá)圖譜，通過雙向電泳己分離出約1000個(gè)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，經(jīng)軟件分析發(fā)現(xiàn)，除其中50個(gè)蛋白斑點(diǎn)外，大部分蛋白質(zhì)的表達(dá)量均未發(fā)生變化。上述50個(gè)發(fā)生變化的蛋白斑點(diǎn)酶切后，再經(jīng)過ESI-MS/MS鑒定和質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)的搜索，共鑒定出28個(gè)蛋白，其中12個(gè)為上調(diào)蛋白，16個(gè)下調(diào)蛋白，根據(jù)

8、其主要功能分為與代謝、細(xì)胞擴(kuò)展、翻譯后修飾以及信號(hào)相關(guān)的蛋白。經(jīng)過Nif處理后，花粉管中碳水化合物代謝能力下降，ATP的產(chǎn)生受到抑制，參與細(xì)胞壁多糖合成及小泡運(yùn)輸?shù)牡鞍?，如valosin containing protein(VCP)、reversibly glycolsylated polypeptide(RGP)、UDP-glucose dehydrogenase(UDPGDH)和α-tubulin表達(dá)下調(diào)。另外，通過上述方法還鑒定