牛免疫球蛋白重鏈基因中JH，Eμ片段敲除的研究和JH，Cμ基因的分析.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)綜合基因小鼠抗體基因成功敲除的經(jīng)驗(yàn)和?？贵w重鏈基因的特點(diǎn)，選擇?？贵w重鏈基因中JH區(qū)的4，5，6外顯子及E μ片段作為目的基因，構(gòu)建了基因敲除打靶載體。 根據(jù)已發(fā)表的?？贵w重鏈基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，以Holstein牛肝臟基因組DNA為模板，擴(kuò)增1.11kb(J)，3.63kb(M1)以及1.12kb(M2)片段。 以J片段作為短同源臂，M1、M2作為長同源臂，分別通過酶切位點(diǎn)Kpn Ⅰ-HindⅢ和EcoR Ⅰ

2、-EcoT22 Ⅰ定向克隆至載體pGTN29-TK，成功構(gòu)建了能夠定點(diǎn)敲除牛JH區(qū)有功能外顯子及其3’端增強(qiáng)子序列的打靶載體pGTN29-TK-J-M2-M1，其中正篩選標(biāo)記基因neo放在長臂與短臂之間，負(fù)篩選標(biāo)記tk位于長臂外側(cè)。 為提高打靶效率，轉(zhuǎn)染前首先線性化打靶載體pGTN29-TK-J-M2-M1，通過脂質(zhì)體和磷酸鈣法轉(zhuǎn)染牛胎兒成纖維細(xì)胞，用G418和GANC兩種藥物進(jìn)行正負(fù)篩選，獲得123個(gè)抗藥性細(xì)胞克隆，挑選單克隆

3、擴(kuò)大培養(yǎng)后，經(jīng)微量PCR鑒定法證明獲得了6個(gè)陽性細(xì)胞克隆。 本實(shí)驗(yàn)通過PCR、RT-PCR和Southern blot分析，證明序列號為AY158087和AY149283的兩個(gè)JH和序列號為AY230207和U63637的兩個(gè)Cμ基因以雙拷貝基因形式存在于?；蚪M中，它們都是功能基因，但表達(dá)水平相差懸殊，NCBIGeneBankTM上登錄的cDNA序列中主要表達(dá)AY158087 JH基因和AY230207 Cμ基因。進(jìn)一步分析發(fā)